马凌风

摘 要：目的：建立威灵壮骨胶囊的质量标准。方法：采用TLC法对处方中的补骨脂和威灵仙进行了定性鉴别研究；采用HPLC法测定淫羊藿苷的含量，选用Cromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；乙腈-水（25：75）为流动相，检测波长270nm，流速1.0ml/min。结果：TLC法可鉴别出补骨脂和威灵仙的特征斑点，专属性强，分离度好；淫羊藿苷浓度在0.021～0.192mg/ml 范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9994），平均回收率为99.38%，RSD=1.61%。结论：该方法简便可行，可用于威灵壮骨胶囊的质量控制。

关键词：壮骨；HPLC；淫羊藿苷

1 仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪，泵LC-10ATVP，检测器SPD-10AVP，EZ色谱工作站；淫羊藿苷对照品（供含量测定用，批号：110737-200414，中国药品生物制品检定所），补骨脂素对照品（供含量测定用，批号：110739-200511，中国药品生物制品检定所），齐墩果酸对照品（供含量测定用，批号：110709-200304，中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯；样品：威灵壮骨胶囊（自制，批号120101，120102，120103）。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 补骨脂的鉴别

取样品5g，研细，置具塞锥形瓶中，加氨水2ml，静置1小时，加三氯甲烷20ml，超声30分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml中1mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方量及制备工艺要求制成不含补骨脂的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。

2.1.2 威灵仙的鉴别

取样品10g，研细，加乙醇50ml，加热回流2小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加盐酸3ml，加热回流1小时，加水10ml，放冷，加石油醚（60～90℃）25ml振摇提取，石油醚蒸干，残渣用无水乙醇10ml溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.45mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方量及制备工艺要求制成不含威灵仙的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20：3：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

Cromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；乙腈-水（25：75），检测波长270nm，流速1.0ml/min，进样量10μl，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷对照品5.32mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含淫羊藿苷浓度为0.2128mg/ml的母液，精密吸取5ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物约0.7g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理（功率250W，25kHz）1小时，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

按威灵壮骨胶囊的制备工艺制成不含淫羊藿的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液按上述色谱条件进行测定，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无干扰，见图1。

2.2.6 线性关系考察

精密吸取淫羊藿苷对照品母液（浓度：0.2128mg/ml）1、3、5、7、9ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取上述溶液各10μl注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。以峰面积（A）和浓度（C）作线性回归，得回归方程为A= 1746301C+1248，r=0.9994。结果表明淫羊藿苷进样浓度在0.021～0.192mg/ml范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验

取淫羊藿苷对照品溶液（浓度：0.106mg/ml），连续进样6次，每次10μl，记录峰面积，计算RSD为0.81%。

2.2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、1、1、3、4、5h注入高效液相色谱仪，记录峰面积，峰面积的RSD為0.95%。结果表明供试品溶液5小时内稳定。

2.2.9 重复性试验

取同一批样品，按供试品溶液的配制方法配制6份供试品溶液，按上述方法测定淫羊藿苷的含量，结果淫羊藿苷的平均含量为每粒1.20mg，RSD为1.63%。

2.2.10 加样回收率试验

精密称取已测含量的同一批样品约333mg（淫羊藿苷的含量为每粒1.20mg），共6份，分别精密加入一定量的淫羊藿苷对照品，按上述供试品溶液制备方法制得供试品溶液6份，再按上述色谱条件测定。计算加样回收率。结果见表1。

2.2.11 样品测定

取不同批号的3批样品，按拟定的含量测定方法测定，以外标法计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 本文通过实验，确定了威灵壮骨胶囊中补骨脂和威灵仙的薄层色谱鉴别方法，阴性对照表明其他成分对本法无干扰，说明该方法专属性较强，结果可靠。

3.2 淫羊藿为本品的君药，主要含黄酮类化合物、淫羊藿苷、木脂素、生物碱、挥发油等成分，有补肾壮阳；祛风除湿；强筋键骨的功效，其中淫羊藿苷具有抗骨质疏松作用和保护激素诱导的HBMEC损伤等作用[2，3]，故本品采用淫羊藿苷为考察对象，采用高效液相色谱测定淫羊藿中淫羊藿苷的含量，专属性强，分离度好，准确度高，可用于威灵壮骨胶囊的质量控制，根据测定结果，暂定本品含淫羊藿以淫羊藿苷计每粒不得低于0.8mg。

参考文献

[1]姜明章，冯景辉，孙大勇，等.穿龙骨刺胶囊质量标准研究[J].齐鲁药事，2011，30（3）：142-145.

[2]张金娟，文娱，张贵林，等.淫羊藿苷对骨质疏松模型小鼠骨组织形态计量学指标的影响[J].贵州医药，2010，34（5）：404-405.

[3]王佰亮，李子荣，娄晋宁，等.淫羊藿苷对糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国微循环，2009，13（6）：461-464.