陈 倩，丛玉艳，刘兴伟，宋先忱

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳110866； 2.辽宁省畜牧科学院，辽宁 辽阳 110000)

在山羊生产中，采用冷冻精液输精普遍导致母羊受胎率低，极大降低了山羊的繁殖力，解冻温度和时间通过影响解冻后精液品质而影响受胎率。卜书海等[1]建议在实践中采用75 ℃解冻奶牛细管冻精2～6 s，Olesenz[2]直接把0.25 mL绵羊细管冻精放于70 ℃水浴中解冻8 s，目前，辽宁绒山羊细管冻精的解冻温度以38～40 ℃为主。本试验旨在研究不同解冻方法对绒山羊细管冻精解冻后精子品质的影响，以期明确绒山羊细管冻精的适宜解冻方法，从而为提高其解冻后的精子活力和受胎率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料 选择2周岁的辽宁绒山羊种公羊6只，用假阴道法采集精液，经检查精子活力达标(均高于65%)后混精(精子活力为75%)，然后制成0.25 mL细管冻精，于液氮中保存备用。

1.2试验设计 本试验分别采用37 ℃ 12 s、39 ℃ 8 s和70 ℃ 4 s 3种方法对细管冻精进行解冻，通过对精子活力、精子存活时间、顶体完整率和畸形率，以及解冻后精清(该部分实质是精清+稀释液，简称“精清”)酶进行分析，并结合升温曲线，以研究解冻方法对绒山羊细管冻精精子品质的影响。

1.3指标测定 精子活力：在37 ℃下，借助400倍显微镜，观察视野中直线前进运动精子占总精子数的百分比。

精子存活时间：在37 ℃水浴中保存解冻精液，从第3小时开始，每隔1 h进行一次活力检测，直到精子全部死亡为止。具体方法是由第1次检查时间到倒数第2次检查之间的间隔时间，加上最后1次与倒数第2次间隔时间的一半，其总时间即为精子存活时间。

顶体完整率：将精液样品制作抹片，经干燥、固定、水洗、姬姆萨染色并风干后，置于1 000倍生物显微镜下观察。精子顶体完整率=顶体完整型精子数/精子总数×100%。精子畸形率：将精液样品制作抹片，经干燥、固定、水洗、美蓝染色、水洗并风干后，置于显微镜下检查。精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%。

精清部分酶活性：将解冻后的精液在4 ℃、2 000 r·min-1条件下离心10 min，收集精清部分，分别利用谷草转氨酶(GOT)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、山羊透明质酸酶(HYD)酶联免疫分析试剂盒，测定其中GOT活性、LDH活性和HYD含量。

升温曲线：采用温度控制仪检测冻精解冻过程中的温度变化情况。

1.4数据统计分析 数据采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1解冻方法对解冻后精子品质的影响 解冻方法对解冻后精子活力的影响显著(P<0.05)。70 ℃下解冻4 s的精子活力显著高于37 ℃ 12 s的(P<0.05)，与39 ℃下解冻8 s的差异不显著但有增高趋势(P>0.05)(表1)。解冻方法对解冻后精子存活时间的影响不显著(P>0.05)，但对精子顶体完整率的影响显著(P<0.05)，70 ℃下解冻4 s的精子顶体完整率显著高于其余两解冻方法，37 ℃ 12 s较39 ℃ 8 s解冻的精子顶体完整率显著增高(P<0.05)。解冻方法对精子畸形率的影响显著(P<0.05)，70 ℃下解冻4 s的精子畸形率显著低于其余两解冻方法，37 ℃下解冻12 s的精子畸形率显著低于39 ℃ 8 s(P<0.05)。

2.2解冻方法对解冻后精清酶的影响 解冻方法对冻精解冻后的精清GOT活性、LDH活性和HYD含量均有显著影响(P<0.05)，其中70 ℃ 4 s解冻后的精清GOT活性显著低于37 ℃ 12 s和39 ℃ 8 s(P<0.05)，后两种解冻方法间差异不显著(P>0.05)；而70 ℃ 4 s 的精清LDH活性和HYD含量均显著低于37 ℃ 12 s(P<0.05)，且与39 ℃ 8 s差异不显著但有降低的趋势(P>0.05)(表2)。

2.3各解冻方法解冻时的升温曲线 37 ℃解冻12 s时精液的温度为29.4 ℃，经过危险温区(-25～-5 ℃)所用的平均时间为1.69 s，在此温区内升温速率为11.85 ℃·s-1；39 ℃ 8 s冷冻精液温度为17 ℃，经过危险温区所用的平均时间为1.60 s，在此温区内升温速率为12.48 ℃·s-1；70 ℃ 4 s冷冻精液温度为6.6 ℃，经过危险温区所用的平均时间为0.74 s，在此温区内升温速率为27.06 ℃·s-1(图1)。可见，70 ℃ 4 s的解冻方法冷冻精液解冻后温度最低，其次是39 ℃ 8 s，最高是37 ℃ 12 s；经过危险温区速率最快的是70 ℃ 4 s，其次是39 ℃ 8 s，最慢的是37 ℃ 12 s。

3 讨论

3.1解冻方法对绒山羊细管冻精精子品质的影响 精子的活动能力与精子的受精力和受胎率有着密切关系[3]，精子活力和顶体形态可作为判断受胎率的指标[4]。Saacke和White[5]报道，顶体完整率与90 d不返情率的相关系数为0.81。Januskauskas等[6]也发现，牛冷冻精液解冻后的精子活力与穿卵精子数及56 d不返情率呈极显著正相关。因此，观察精子的活力、存活时间、顶体完整率和畸形率，对评价冻精解冻方法的优劣具有重要意义。

表1 各解冻方法解冻后精子品质的统计结果Table 1 Sperm quality of thawed semen with different thawing method

表2 解冻方法对解冻后精清酶的影响Table 2 Enzyme in seminal plasma of thawed semen with different thawing method

图1 各解冻方法解冻时冷冻精液的升温曲线Fig.1 The temperature-rising curve of frozen semen thawed with different method

近年来，绵羊细管冷冻精液的解冻温度和时间变化很大。Paulenz等[7]对绵羊细管冻精用不同解冻方法(70 °C 8 s、50 °C 9 s或 35 °C 12 s)解冻后配种发现，35 °C解冻的产羔率最高。此外，Maxwell等[8]主张将细管冻精在37 ℃水浴中解冻60 s，Graham和MocÉ[9]提出的解冻方法是39 ℃解冻30 s，常永梅[10]发现最佳解冻方法为40～44 ℃解冻8 s，而Olesenz[2]建议在70 ℃水浴中解冻8 s，世界范围内大都倾向于采用35～40 ℃解冻。目前辽宁绒山羊的细管冻精的解冻方法以38～40 ℃为主，冯霞等[11]通过对精子活力的比较发现，辽宁绒山羊细管冻精的最佳解冻温度为38 ℃，解冻时间为60 s，精子活力平均为40.3%。

世界范围内解冻温度不一致可能主要由于羊品种的特异性及精子膜对冷冻解冻温度骤变的敏感性不同造成，膜受损伤的程度及精子的畸形率也不同，从而精子细胞表现出不同的活力[12]。解冻时要求精子细胞尽快越过危险温区(-25～-5 ℃)，避免低温对精子的损伤[13]。在本研究中，在70 ℃下解冻，精子经过危险温区速率最快，对精子细胞损伤小，精子活力和顶体完整率显著高于在37 ℃ 12 s和39 ℃ 4 s的解冻效果，70 ℃ 4 s的解冻方法对保持精子的正常形态较为有利。然而Pontbriand等[14]发现，35～40 ℃或50～70 ℃解冻对绵羊精子存活率或顶体完整性和产羔率无影响，而渊锡藩等[15]认为，解冻温度太高或太低都不理想。这些不同研究结果的产生可能与品种间的差异有关。

3.2解冻方法对绒山羊细管冻精解冻后精清酶的影响 酶是精清、精子的重要组成成分，对维持精子的正常代谢发挥着重要作用。精子在解冻过程中冰晶的消失会对精子造成机械性损伤，当精子线粒体受到损害时，相关酶类就向精清中逸出，因而精子中的酶活性下降、精清中的酶活性上升，从而导致精子受精能力下降。因此，精清中的酶活性可作为衡量精液质量的生化指标，能判断精子在解冻过程中的受损程度。

精子中GOT与精子低温损伤的程度有关，GOT的释放量与解冻精子活力存在显著负相关[16]。精清中酶活性变化及其与精子顶体损伤间有密切关系。西门塔尔牛冻精解冻后精清中GOT活性与精子活力和顶体完整率显著负相关[17]。LDH与精子运动及存活的供能过程有密切关系。LDH活性可以作为衡量猪精液品质的一个指标，并且能够反映经稀释液处理体外保存后精子的活力情况[18]。精液中HYD含量与精子活力、顶体完整率呈负相关，因此可以把测定精清中HYD活性作为预测受胎率高低的指标。Foulkes和Watson[19]以精清中HYD的活性评定牛精子的完整性。Crabo和Graham[20]测定猪冷冻精液中的GOT活性和精子中的HYD活性及精子顶体完整率，以作为实验室评定精液品质的方法。本研究发现，70 ℃ 4 s解冻方法可有效降低绒山羊细管冻精解冻后精清的GOT活性、LDH活性和HYD含量，这表明该解冻方法可降低解冻对精子的损伤，从而有利于保持精子的正常形态和活力，有望提高配种受胎率。

4 结论

70 ℃ 4 s的解冻方法能使绒山羊细管冻精在解冻过程中快速通过危险温区，有效缓解解冻对精子的损伤，对保持精子的正常形态和活力较为有利。

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