夏天无的试管苗诱导

2013-04-25杨寅桂曾勇军周庆红

草业科学 2013年12期

郑咪，杨寅桂，曾勇军，周庆红

(江西农业大学农学院作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室，江西南昌 330045)

夏天无(Corydalisdecumbens)又名一粒金丹，落水珠，为罂粟科紫堇属伏生紫堇多年生草本植物[1]。在我国主要分布于江西、湖南、福建、浙江、安徽和江苏等省(区)，适宜在气候温暖潮湿、土层深厚的沙质土壤地区生长[2]。夏天无为传统中药材，其块茎中含有多种具有活性成分的生物碱，具通络活血祛瘀、行气止痛解痉等功效[3-5]。近年来，以夏天无有效成分为主的制剂有夏天无片、夏天无注射液、夏天无眼药水等，在防治脑梗死、周围神经损害性瘫痪、腰椎间盘突出症、坐骨神经痛、关节腰腿等疼痛及中小学生假性近视中有较好疗效[6-7]。近年来，为满足药材市场需求，野生夏天无被过度采挖，导致其资源日渐减少。为了解决夏天无的供需矛盾和保护野生资源，江西省余江、樟树等地正在尝试进行人工栽培。其栽培时间为10月中下旬到次年4月中旬，生产中与水稻(Oryzasativa)轮作，是冬闲经济作物。这对于保护夏天无野生资源、供应药材市场需求、增加农民收入具有重要意义。但夏天无以地下块茎为繁殖器官，留种时间为4月中下旬至10月中下旬，期间历经夏季高温，种茎易腐烂难保存，据我们前期调查统计，夏天无块茎贮藏期烂种率达到40%～60%，大大增加了留种量；而且大多数留种块茎表面带菌，造成夏天无品质退化，产量下降等问题。人工种植另一问题是块茎用种量较大，每亩平均用种量为35 kg，约为最终产量的1/8。植物离体快繁技术日趋成熟，而且再生植株能够较好地保持物种本身的生物特性和遗传特性。因此，针对目前夏天无生产种源不足、品质下降等现实问题，采用植物组培技术对夏天无进行试管苗诱导，以解决夏天无生产的实际需求，对夏天无种质资源保存和生产意义重大。

近年来，利用组织培养技术对植物试管苗诱导的研究已有大量报道，但有关夏天无及其同属植物组织培养方面的研究报道尚不多见。谢赛萍[8]以地下块茎和叶片为外植体对大叶元胡(Corydalisyanhusuo)的愈伤组织和试管块茎诱导进行了研究，并获得了大叶元胡试管块茎诱导的最佳培养基及培养条件；Noboru等[9]以切成薄片的延胡索(C.ambigua)块茎为外植体进行了组培快繁研究，并通过激素诱导获得了愈伤组织和再生植株，并对其再生植株的遗传稳定性进行了分析。本研究分析不同培养温度、激素浓度、芽切取部位对夏天无块茎出芽、芽增殖及试管苗生根情况的影响，确定夏天无试管苗诱导的最佳培养条件，以期为夏天无离体快繁和再生体系的建立提供基础。

1 材料与方法

1.1试验材料以江西省余江县人工种植的夏天无块茎(两年生，块茎平均直径为1.16 cm)为试验材料。

1.2试验方法

1.2.1外植体的消毒选取大小一致的夏天无块茎，流水冲洗1 h后置于超净工作台上消毒。具体做法是无菌蒸馏水冲洗1次，75%酒精浸泡30 s，无菌蒸馏水再冲洗3次， 0.1% HgCl2溶液浸泡20 min[10]，最后用无菌水冲洗5次后备用。

1.2.2块茎出芽诱导以1/2 MS为基本培养基(附加蔗糖30 g·L-1、琼脂7.5 g·L-1，pH 5.8)，将已消毒块茎分别接入附加不同浓度6-BA、NAA的培养基中(表1)，筛选6-BA和NAA的最佳浓度配比；在此基础上，分别添加0.5、1.0和2.0 mg·L-1的GA3，并对GA3的浓度进行选择。将接入块茎的培养基分别放入16、20及24 ℃的人工气候培养箱中培养，诱导块茎出芽，光照时间14 h·d-1，光照强度2 500 lx，每个处理接种8瓶，每瓶接种8个块茎。15 d后观察记载块茎出芽数及芽生长情况。

表1 夏天无块茎出芽诱导培养基配方Table 1 Formulations of buds induction for the tuber of Corydalis decumbens mg·L-1

1.2.3芽增殖诱导以两种方式切取块茎上的芽，一种是只切取单芽，另一种是芽和其基部的块茎表皮一同切取。切取后分别接入到附加不同浓度的6-BA(1.5、2.5、3.5和4.5 mg·L-1)，0.1 mg·L-1NAA ，0.5 mg·L-1GA3的培养基中，置于人工气候箱中培养，光照时间14 h·d-1，光照强度2 000 lx，培养温度为16 ℃(前期筛选)，每个处理接10瓶，每瓶接种4个芽。每天观察芽的长势及增殖情况，20 d后统计芽增殖数。

1.2.4试管苗诱导从培养基中将增殖芽取出，分切成单芽，然后将单个芽接入附加不同浓度6-BA、NAA和GA3的培养基中(表2)，每个处理接种8瓶，每瓶接种4个芽，最后置于光照时间10 h·d-1，光照强度1 500 lx，培养温度为16 ℃的人工气候培养箱中培养。30 d后观察芽的成苗数、试管苗生长及生根状况。

表2 夏天无试管苗诱导配方Table 2 Formulations of test-tuber plantlets of Corydalis decumbens mg·L-1

1.2.5统计分析

增殖率=(增殖芽总数/接种芽总数)×100%；

出芽率=(发芽总数/接种总块茎数)×100%。

芽增殖率的每组数据以平均值和标准误差(SD)表示。数据采用DPS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1不同温度对诱导块茎出芽的影响培养温度对夏天无块茎出芽影响较大(图1)，3种温度下，诱导块茎出芽数存在显著差异(P<0.05)(表3)。16 ℃下，夏天无出芽最早，块茎平均出芽数最多，为3.63，芽健壮，浅紫色，后期芽长势快；20 ℃下可以诱导夏天无块茎出芽，但块茎平均出芽数极低，为1.37，芽瘦小，白色，芽后期长势不理想。而当温度达到24 ℃时，夏天无块茎不出芽。由此可见，诱导夏天无块茎出芽较适宜的温度为16 ℃。

图1 夏天无试管苗诱导Fig.1 Induction of test-tube plantlets in Corydalis decumbens

表3 不同温度对块茎出芽诱导的影响Table 3 Effects of different temperatures on the buds induction of the tuber of Corydalis decumbens

表4 不同浓度6-BA、NAA对块茎诱导出芽的比较Table 4 Comparison of the bud induction from the tuber of Corydalis decumbens with different concentration of 6-BA、NAA

2.2不同浓度6-BA和NAA对块茎诱导出芽的影响将夏天无块茎分别接种到12种不同6-BA和NAA激素组合的培养基上进行出芽诱导，结果表明(表4)，夏天无块茎在添加有不同浓度6-BA和NAA培养基上培养时，其出芽时间、出芽数和芽生长势均存在显著差异(P<0.05)。在4种6-BA浓度中，诱导出芽效果最好的为2.5 mg·L-1，而高浓度的NAA会抑制芽的生长；在3种NAA浓度中，以0.1 mg·L-1NAA对芽的生长最为有利；在12种激素组合中，以A4培养基(2.5 mg·L-16-BA，0.1 mg·L-1NAA)诱导块茎出芽效果最佳，块茎出芽时间也最早，接种19 d后即有芽出现，并且平均出芽数最高，为3.84，芽健壮，呈紫色。

在1/2 MS+2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培养基上添加GA3后，诱导块茎出芽时间都不同程度地缩短，芽生长更为健壮(表5)，说明GA3确实有打破块茎休眠和促进芽生长的作用。但不同GA3浓度对诱导块茎出芽数存在极显著差异 (P<0.05)。在添加了0.5 mg·L-1GA3的培养基上，诱导夏天无块茎出芽最快(12 d)，块茎平均出芽数最多，为3.87，且芽生长健壮。而当GA3浓度增加时，块茎平均出芽数减少，同时出芽时间延长。由此可见，高浓度的GA3对诱导块茎出芽具有抑制作用，在1/2 MS+2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培养基上加入0.5 mg·L-1GA3有利于块茎诱导出芽。

2.3不同浓度6-BA对夏天无芽增殖的影响将夏天无块茎上诱导出的芽接入含不同浓度6-BA的培养基中，7 d后芽周围均出现少量白色愈伤组织，到15 d左右，外植体周围慢慢出现丛生芽，30 d后，芽不再增殖。当6-BA的浓度为3.5 mg·L-1时，增殖芽数最多，平均单芽增殖率为3.65，显著高于其它浓度培养基的诱导效果，且增殖芽生长健壮，长势较好；当6-BA的浓度为1.5 mg·L-1时，平均单芽增殖率为2.90，后期增殖芽生长缓慢，芽瘦小。而当6-BA浓度达到4.5 mg·L-1时，平均单芽增殖率为3.35(表6)。由此可见，当6-BA的浓度为3.5 mg·L-1时，有利于诱导芽的出现和增殖。

2.4不同切取部位对夏天无芽增殖的影响将块茎诱导出的芽以两种方式切取，即仅切取单芽和芽连同芽基部块茎表皮一同切取，将切下的芽接入1/2 MS+3.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培养基上，5 d后观察发现(表7)，两种切取方法对夏天无增殖芽的诱导数存在显著差异。以连同块茎表皮一起切下的芽基部芽眼长出丛生芽后,基部切口处产生少量愈伤组织，不久愈伤组织分化成芽，单芽平均增殖数为3.71；而切取的单芽接种于同样培养基后，芽基部则不会出现丛生芽，但不久会在芽基部切口处产生大量愈伤组织，并很快分化成芽，单芽平均增殖数为3.43；由此看来，带块茎表皮芽的增殖总数高于不带块茎表皮的芽，且后期丛生芽长势健壮。

2.5不同激素对试管苗形成的影响将继代增殖的芽切成单个芽接入附加不同浓度NAA的培养基中，20 d后观察试管苗的生长状况，在没有添加6-BA、NAA的培养基上，试管苗生长健壮，并产生大量不定根，后期试管苗生长快(表8)。在添加低浓度6-BA(0.1 mg·L-1)的培养基上，夏天无幼苗长势差，叶不能正常伸展，生成不定根的数量随NAA浓度的增加而减少；当6-BA浓度增加至0.5 mg·L-1时，夏天无幼苗长势更弱，叶不伸展，且不能形成不定根，后期试管苗基部出现少量愈伤组织，直至幼苗褐化死亡。在只添加NAA的培养基上，低浓度的NAA可诱导少量不定根的产生，但因为不定根数量少，后期试管苗叶片生长缓慢，最后出现黄化、枯死等现象；高浓度的NAA则抑制不定根的形成。由此可见，试管苗形成和生根以未添加任何激素的1/2 MS基本培养基最佳。

表5 不同浓度GA3对块茎诱导出芽的影响Table 5 Effects of different concentrations of GA3 on the buds induction for the tuber of Corydalis decumbens

表6 不同浓度6-BA对芽增殖的影响Table 6 Effects of different 6-BA concentrations on buds proliferation of Corydalis decumbens

表7 不同切取部位对夏天无芽增殖影响Table 7 Effects of different cutting sites on buds proliferation of Corydalis decumbens

表8 不同激素对试管苗生根及生长的影响Table 8 Effects different hormones on plantlets rooting and growth of Corydalis decumbens

3 讨论与小结

3.1温度对夏天无试管苗诱导的影响温度是影响植物生长发育的重要因素，也是植物组织培养中不可忽视的条件。植物组织培养的温度一般为25 ℃左右，但也有些植物离体培养需要较低或较高温度条件，研究表明，适当降低培养温度(15 ℃)可以有效降低香石竹(Dianthuscaryophyllus)玻璃苗的比例，提高苗的健壮程度及移栽成活率[11]；适宜的低温有利于黄芪(Astragalusmembranaceus)短枝的生长，以20 ℃培养效果最好[12]； 25 ℃最适合铁皮石斛(Demdrobiumcardidum)原球茎的生长繁殖，而较低的温度(23 ℃)有利于减少分生苗的数量，形成健壮高大的试管苗[13]。王碧琴等[14]对木兰科7种植物的组织培养技术研究发现，外植体分化的最适温度在20～23 ℃，过高过低都不利于产生不定芽。本研究中，在24、20和16 ℃3种温度下对夏天无试管苗进行诱导，结果发现16 ℃是诱导夏天无块茎出芽、芽增殖以及试管苗生长的最适温度，原因可能是夏天无块茎在较高温度下处于休眠状态，低温有利于打破其休眠，诱导出芽。夏天无植株在冬季生长，适应了冷凉的气候，因此，在离体培养状态下也适宜在较低温度下生长，20 ℃以上的培养温度会抑制其生长。

3.2激素对夏天无试管苗诱导的影响激素在植物组织培养过程中起着重要作用[15]。一般诱导不定芽的形成时细胞分裂素高于生长素的用量，而诱导不定根发生只用生长素或配合使用较低浓度的细胞分裂素[16]。在培养基MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA上，钝叶瓦松(Orostachysmalacophyllus)腋芽增殖效果最好，增殖倍数为5.35，苗的长势也较好；而最佳的生根培养基为1/2 MS+0.3 mg·L-1NAA，生根率达96.67%[17]。脱毒快繁研究菊薯(Smallanthussonchifolius)茎段增殖的最适培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，最适生根培养基为1/2 MS+0.01 mg·L-1NAA[18]。本研究表明，在培养基上添加适宜浓度的6-BA和NAA时，夏天无块茎能够较快出芽，常规繁殖的夏天无块茎往往只有1～2个芽萌发，而激素诱导下的块茎则显示出较强的萌芽力，萌芽数多在3～4个，特别是在添加GA3(0.5 mg·L-1) 的培养基中，夏天无块茎出芽更快，且诱导出的芽更健壮。本试验结果与董少鹏和柏峰[19]研究GA3对玫瑰(Rosarugosa)茎芽诱导的结论一致。

激素浓度也是影响芽增殖的重要因素，一定浓度的6-BA对打破蝴蝶兰(Phalaenopsisamabilis)腋芽的休眠具有重要作用[20]，6-BA对大蒜(Alliumsativum)芽的增殖具有明显效果[21]，6-BA在1.26～1.99 mg·L-1的范围时最有利于何首乌(Polygonummultiflorum)不定芽的增殖[22]。本研究在芽增殖的培养基中添加6-BA、NAA和GA3可以有效诱导芽的增殖，筛选到的夏天无芽增殖的最佳培养基为1/2 MS+3.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3，且丛生芽生长健壮。

不定根的形成是组织培养过程中的关键环节，它直接影响试管苗的长势和后期移栽成活率的高低，关系到组织培养成败。1/2 MS培养基附加0.5 mg·L-1IBA 是喜树(Camptothecaacuminata)组培苗的最佳生根培养基[23]；六棱景天(Sedumsexangulare)的最佳生根培养基为1/4 MS+0.05 mg·L-1NAA+0.01 mg·L-1IBA[24]；诱导蝴蝶兰生根的最佳培养基为 1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA ，诱导的生根率为98%[25]；毛脉酸模(Rumexgmelini)最佳生根培养基为无激素的MS培养基，生根率可达92%[26]。本研究也表明，不添加NAA或是低浓度的NAA对夏天无试管苗不定根的形成更有利。

另外，本研究将块茎诱导出的芽以两种方式切取，结果表明，切取的带块茎表皮芽的增殖总数高于不带块茎表皮的芽增殖总数，且后期丛生芽长势健壮。这可能有两个原因，一是带块茎表皮的芽基部潜伏芽在外源激素的刺激下，加上培养基充足的营养，使这部分芽能够得以萌发并且生长良好。另外切口处在外源激素的诱导下能够产生愈伤组织并分化成芽，因此带块茎表皮芽的增殖效果好于不带块茎表皮的芽。

本研究以夏天无休眠块茎为外植体，首次成功建立了夏天无组织培养再生体系，为夏天无微块茎繁殖和组培苗的移栽，大面积的人工栽培及其工厂化生产提供了一定的理论基础与科学依据，为夏天无种质资源保存和可持续开发利用奠定了基础。

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