魏 涛，王丽娟，毛多斌，陶 静，刘苏萌，马歌丽，何培新

（郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

一些微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源在菌体内合成并积累油脂，油脂含量超过总生物量的20%，即称为产油微生物。产油微生物所产生积累的油脂称为微生物油脂[1-3]。目前已报道霉菌、酵母菌、细菌以及藻类的某些菌株都可以产生大量油脂，但以斯达油脂酵母菌（Lipomyces starkeyi）、粘红酵母属（Rhodotorula glutinis）、曲霉属（Aspergillus）以及毛霉属（Mucor）等真核微生物常见[4]。随着化石能源的短缺，石油价格的不断攀升，寻找新的可再生资源成为当今世界各国的一个重要议题。通过生物化工和微生物发酵制取能源产品与化学品，部分替代化石资源，将是多渠道开发可再生资源的必然趋势。利用微生物生产油脂在开发新油脂资源方面具有良好的发展前景，因此探索研究微生物积累油脂具有重要的现实意义[5-6]。

利用微生物生产油脂具有不受季节和气候的影响、生产原料来源广泛、油脂含量高、质量稳定、可连续进行大规模生产和生产周期短等优点[7-8]。本研究以粘红酵母菌H810为出发菌株，通过单因素和正交试验优化粘红酵母菌H810产油脂培养基的组成和培养条件，分析了在优化条件下油脂成分，旨在提高粘红酵母菌H810生物量和油脂产量，为其进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

粘红酵母菌H810，本实验室选育菌种。葡萄糖、酵母膏和蛋白胨均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；所用化学试剂乙醚、甲醇等购自天津市德恩化学试剂有限公司，均为分析纯。

种子斜面保藏酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract pep tone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，自然pH；

液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉0.5g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，自然pH；

摇瓶发酵基础培养基：葡萄糖70g/L，硫酸铵1g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁1g/L，自然pH。

以上培养基均在121℃饱和蒸汽下灭菌15min。

1.2 仪器与设备

HZQ-Y电热鼓风干燥箱：上海左科仪器设备有限公司；SHB-3循环水多用真空泵：郑州杜甫仪器厂；SCT-06索氏提取仪：上海洪纪仪器设备有限公司；LA-230S型电子天平：北京赛多利斯有限公司；GC6890气相色谱：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 粘红酵母的培养

培养斜面上将一环活化菌体接于80mL液体种子培养基中，28℃、180 r/min摇床培养20h～28h。以10%接种量接种于80mL发酵基础培养基中，在相同条件下培养96h。

1.3.2 油脂提取与测定

粘红酵母生物量测定：将培养好的菌体8000r/min离心15min，去除上清液，得到湿菌体，110℃烘干至质量恒定，自然冷却至室温后称质量，即为菌体干质量，以g干菌体/L发酵液表示菌体生物量。

菌体油脂的含量测定：参照索氏抽提法直接进行油脂抽提[9-10]。菌体烘干，研磨粉碎后取一定质量的干菌体粉末用滤纸包好，放入索氏抽提器的提取管中，以60℃～90℃沸程的石油醚为抽提剂，水浴提取6h～8h，取下抽提瓶，在93℃水浴中挥发掉残留石油醚，再于95℃～105℃烘干2h，准确称量粗油脂质量。油脂含量按下式计算：

式中：X 为样品中油脂的质量分数，%；m为样品的质量，g；m0为油脂抽提瓶的质量，g；m1为油脂及油脂抽提瓶的质量，g。

油脂脂肪酸组分分析：采用气相色谱法分析油脂脂肪酸组分。气相色谱（GC）条件[11-12]：GC6890气相色谱仪进行分析，氮气为载气，毛细管色谱柱HP-5MS（30m×0.25mm×0.2μm），柱温初温200℃，程序升温，以5℃/min速度升至220℃，保温30min，进样口温度240℃，分流比1∶25，进样体积2μL。

2 结果与讨论

2.1 碳源的选择

碳源是微生物生长繁殖最重要的营养成分，而粘红酵母H810对不同碳源的利用能力和速度是不同的，本研究考察了在葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖和麦芽糖在不同碳源下（碳源添加量5%），粘红酵母H810菌体生物量和细胞油脂含量的变化情况，结果见图1。

图1 不同碳源对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Fig.1 Effect of carbon sources on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

由图1可知，粘红酵母H810利用碳源的能力为葡萄糖＞木糖＞阿拉伯糖＞蔗糖＞淀粉＞乳糖＞麦芽糖。葡萄糖是菌体细胞生长的最佳碳源，也是菌体油脂合成的最适碳源，添加5%葡萄糖，其培养液生物量达到34g/L，菌体油脂含量达到49%。

2.2 氮源的选择

适宜种类和浓度的氮源不仅能促进粘红酵母菌H810高效利用葡萄糖、木糖等碳源，而且可以减少次级代谢产物的形成。由图2可知，不同氮源（氮源添加量5%）对粘红酵母H810生长影响较大。

图2 不同氮源对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

由图2可知，粘红酵母H810利用氮源的能力为酵母膏＞磷酸二氢铵＞硫酸铵＞蛋白胨＞硝酸铵＞尿素。酵母膏是粘红酵母H810菌体细胞生长和合成油脂的最适氮源，添加5%酵母膏，其培养液生物量达到32g/L，菌体油脂含量达到47%。

2.3 碳氮比（C/N）的选择

微生物细胞生长需要充分的氮源，而油脂的合成一般在氮源耗尽而碳源丰富的条件下，C/N的高低对菌体细胞的生长和油脂的合成影响较大[13]。实验选择葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源，考察不同的C/N对菌体生物量和油脂含量的影响。由表1可知，C/N为40时，粘红酵母H810的菌体生物量和油脂含量为最高，过高和过低的比例都不适合酵母菌体生长和油脂产生。

表1 C/N对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Table 1 Effect of C/N on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.4 培养温度

培养温度是影响粘红酵母H810油脂合成的一个重要条件。由图3可知，在28℃时，粘红酵母H810产油脂率最高，温度过高或过低油脂产量均明显下降。培养温度28℃作为粘红酵母H810的最佳产脂温度。

图3 不同温度对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Fig.3 Effect of culture temperatures on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.5 培养基初始pH值

发酵培养基初始pH值是影响粘红酵母H810菌体生长和油脂产量的一个重要条件，合适的pH值可以促进产油酵母的生物量和油脂合成[14-15]。由图4可知，在初始pH值高于或低于6.8时，粘红酵母H810生物量和油脂产量均明显下降，所以6.8是粘红酵母H810的最佳生长和产脂pH值。

图4 不同pH值对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Fig.4 Effect of pH value on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.6 接种量

接种量是影响微生物油脂产量的重要因素，接种量不同，菌体生物量和油脂产量也不同。接种量过大，菌体生长期细胞数量过多，单细胞油脂产量反而下降，细胞内积存的油脂过多，又会使菌体失去增殖能力，因此应使微生物细胞处于一定数量，以保持菌体的增殖能力和产油生理状态。由图5可知，粘红酵母H810的接种量为6%时，菌体生物量和油脂含量为最高，接种量过大，油脂合成减少。

图5 不同接种量对粘红酵母H810菌体生物量和油脂合成的影响Fig.5 Effect of inoculumu on biomass and lipid content ofRhodotorula glutinis H810

2.7 发酵条件优化正交试验

在单因素试验基础上，以油脂含量为考察指标，选择碳氮比C/N、温度、pH值和接种量4个主要影响因素作4因素3水平L9（34）的正交试验设计，对粘红酵母H810产油脂最佳发酵条件进行优化筛选[8]，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 粘红酵母H810发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition ofRhodotorula glutinis H810

表3 粘红酵母H810产油脂最佳发酵条件正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of lipid content ofRhodotorula glutinis H810

从表2极差结果得出，影响粘红酵母H810油脂含量的因素大小为RA＞RD＞RB＞RC，即碳氮比C/N＞接种量＞温度＞pH。表3方差分析结果表明，碳氮比C/N和培养温度对油脂含量影响极显著；接种量对油脂含量影响显著，培养基初始pH对油脂含量影响不显著。最佳提取条件为A2B2C2D1，即碳氮比C/N为40，接种量为5%，培养温度为28℃，培养初始pH值为6.8。在此最佳条件下进行验证试验，粘红酵母H810油脂含量为56.88%。

2.8 油脂组分分析

菌株H810在优化培养条件下油脂组分分析见表4，油脂中以油酸47.95%为主，其次为亚油酸12.96%、棕榈酸12.34%、α-亚麻酸11.76%和γ-亚麻酸7.30%，多不饱和脂肪酸总含量92%以上，在医药保健行业具有重要工业应用前景。

表4 菌株H810所产油脂组分分析Table 4 Analysis of lipid content produced byRhodotorula glutinis H810

3 结论

本研究在以碳氮比C/N、培养温度、培养pH和接种量各单因素试验基础上，采用正交试验得出了粘红酵母H810产油脂最佳发酵条件，即碳氮比C/N为40，接种量为5%，培养温度为28℃和培养pH值为6.8，在此条件下粘红酵母H810油脂含量达到56.88%，比文献报道高出10%左右[7]。在该条件下粘红酵母H810油脂成分主要包括油酸47.95%、亚油酸12.96%、棕榈酸12.34%、α-亚麻酸11.76%和γ-亚麻酸7.30%。采用该工艺发酵粘红酵母H810生产微生物油脂具有一定的应用价值，也为大规模生产微生物油脂和研究油脂的不饱和性能提供了研究基础。

[1]LIU B,SUN Y,LI Y H,et al.Pregress on microbial glyceride biosynthesis and metabolic regulation in oleaginous microorganisms[J].Acta Microbiol Sinica,2005,45(1):153-156.

[2]PAPANIKOLAOU S,KOMAITIS M,AGGELIS G,et al.Single cell oil(SCO) production by mortierella isabellin grown on high-sugar cotent media[J].Bioresource Technol,2004,95（3）：287-291.

[3]徐 鑫，段仰凯，董晓宇，等.斯达氏油脂酵母产油脂培养基及产油条件的优化[J].太阳能学报，2007，28（8）：857-860.

[4]李永红，刘 波，赵宗保，等.圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究[J].生物工程学报，2006，22（4）：650-656.

[5]惠丰立，张彩莹，褚学英，等.戊糖发酵产油酵母菌的筛选及油脂组分分析[J].太阳能学报，2009，30（1）：107-811.

[6]马丽娟，王海明，温玉风，等.丝状真菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究[J].长春工业大学学报：自然科学版，2008，29（4）：459-463.

[7]刘 玲，金 雨.红酵母产油脂诱变育种及发酵条件的研究[J].粮食与食品工业，2005，12（6）：17-21.

[8]李 建，刘宏娟，张建安，等.微生物油脂研究进展及展望[J].现代化工，2007，27（11）：133-136.

[9]许安邦，林维宣.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1998：139-140.

[10]林维宣.实验设计方法[M].大连：大连海事大学出版社，1995：118-156.

[11]魏 涛，王丽娟，张 飞，等.一株高产油脂酵母菌株的分离鉴定及其油脂组分的分析[J].中国酿造，2013，32（7）：50-52.

[12]张世鹏，刘品何，秦伟帅，等.麦饭石对白兰地中挥发性物质的影响[J].中国酿造，2012，31（10）：116-119.

[13]张 卉，吕秀芳，孙晓雪.广谱碳源产油酵母菌的筛选及培养基优化[J].沈阳化工学院学报，2009，23（2）：124-128.

[14]李永红，刘 波，孙 艳，等.广谱碳源产油酵母菌的筛选[J].中国生物工程杂志，2005，25（12）：39-44.

[15]高 媛，李元媛，王常高，等.高产油脂酵母的筛选及发酵条件的研究[J].化学与生物工程，2010，27（1）：55-58.