黄美艳，唐于平，尚尔鑫，郭建明，刘欣，王林艳，李伟霞，段金廒

[摘要] 目的：应用响应曲面分析法观察归芎药对不同制法、不同配比对DPPH自由基清除率体外抗氧化活性的相互作用研究。方法：采用2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除率法测定当归-川芎10个配比，3种不同提取方法的提取物的抗氧化活性，应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数，建立三维响应面模型，应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果：不同配比不同制法的30个样品，均具有明显的清除自由基活性，且表现出明显的量效关系。水提液的协同作用范围窄，几乎成点状分布，拮抗作用范围呈6条宽窄不一的条带状分布；醇提液的协同作用呈小条状分布，拮抗作用呈点状分布。在先水提后醇提液协同作用呈条状分布（3条），拮抗作用呈点状分布。总之先水提后醇提液的协同作用区域大于醇提液，水提液次之；3种提取方法大部分区域均未表现出明显协同与拮抗作用。结论：采用响应曲面分析法定量研究中药配伍药物相互作用，为相关研究提供了思路与方法的参考。

[关键词] 当归；川芎；药对；抗氧化；DPPH；响应曲面分析法；相互作用

中医多以数味中药配伍形成的方剂为载体治疗疾病[1]。配伍是中药用方的灵魂。药有个性之特长，方有合群之妙用，药物的联合使用才能产生药物的相互作用，主要表现在效应的强度、毒性以及作用时间上的一些变化。两药配伍后可产生相加性、协同性或拮抗性药物相互作用[2]。研究方法有定性的辐射分析法、分数分析法、概率分析法和定量的响应曲面分析法等[3]。

当归-川芎为临床常用药对，历史上许多著名的方剂均是由这2味药物组成，历代许多妇科良方如四物汤及其类方均含有这2味药，但由于不同的配伍比例，使得这些方剂产生了不同的功效及临床主治[4]。现代药理学研究表明归芎药对具有抗氧化作用[5-6]，氧自由基涉及归芎所应用的妇科、内科以及养生等多个领域的病理机制。因此，实验室在前期研究工作基础上[7-17]，选择对DPPH体外抗氧化模型的影响作为评价指标，比较当归和川芎10种配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）与3种提取方法（水提取模拟水煮，50%醇提取模拟酒水煎煮，先水提再95%醇提近似模拟散剂）的提取液的体外抗氧化活性差异，并采用响应曲面分析法，研究当归-川芎体外抗氧化相互作用与量效关系，为揭示当归-川芎药对的配伍用药规律提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 当归为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，来源于甘肃岷县当归GAP种植基地；川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，来源于四川彭州川芎GAP种植基地，并经南京中医药大学严辉博士鉴定。基于响应曲面分析药物相互作用要求，采用Short等[18]提出的辐射（radial slices）设计，将二维坐标平均分成9等分，即得10个归芎药对配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）。对归芎药对不同配比混合药材分别进行热回流水提取、热回流50%醇提取和先水提再用95%醇提，得到相应样品（W-1～W-10，A-1～A-10，WA-1～WA-10），冷藏备用。DPPH（2，2-二苯基-1-苦肼基）购自Sigma-Aldrich公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 A-5002酶标仪（奥地利TECAN公司）；FA1104N精密天平（上海精密科学仪器有限公司）；EPED-T型超纯水器（南京易普易达科技有限公司）。

1.3 DPPH自由基清除能力测定法 DPPH清除率的测定[19]，在96孔板中加入不同提取方法不同配比不同浓度的归芎药对100 μL，终浓度含生药量分别为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16 g·L^-1。加入各样品受试药物后，溶于含0.1 g·L^-1 DPPH的100 μL无水乙醇溶液，避光反应30 min后在517 nm波长下测定其吸光度为A0。同时作空白对照，在517 nm波长下测定其吸光度为A₁。为扣除药物本底颜色对实验的影响，在加入药物后加入无水乙醇在517 nm波长下测定其吸光度A2。每个样品重复6次，按照下式计算各样品受试药物对DPPH清除率：A₁-（A₀-A₂）/A₁×100%，并计算IC₅₀（指DPPH的抑制率为50%时的提取物溶液浓度），IC₅₀越小，抗氧化活性越高。

2 结果

2.1 归芎药对不同比例、不同提取方法的IC₅₀ 不同比例、不同制备方法得到的样品抗氧化能力有所不同。其中，水提液1∶1.192配比最优，1∶0，0∶1配比效果最差；醇提液1∶5.67配比最优，1∶0配比效果最差；先水提后醇提1∶5.67配比最优，1∶1.73配比效果最差，见表1。

2.2 模型参数加合构建响应曲面 本研究应用响应曲面分析法探讨当归-川芎药对对DPPH自由基的抗氧化作用的药效学相互作用规律。由于中药中多成分多靶点的共同作用，本文研究中采用二次多项式来更好的描述两药合用的量效曲线，并以合并指数来描述两药的相互作用强度。为了便于绘图，将合并指数减1，以0作为典型的加和作用。

根据结果得出不同提取方法不同配比当归-川芎的IC₅₀，求算出U_DG和U_CX （U_DG=当归实际用量/IC₅₀，DG；U_CX=川芎实际用量/IC₅₀，CX），U_DG +U_CX=U，以U/ IC₅₀（不同配比）为横坐标，E_清除率表示不同浓度的清除率，以E_清除率/（1-E_清除率）为纵坐标，应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数，见表1，方程为y=ax^b，建立三维响应面模型，应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。

2.3 当归-川芎药对相互作用的评价 在三维响应面模型中，颜色的深浅代表了该点处2药相互作用的强度。根据合并指数的计算方法，当指数接近于0时，提示药物间为相加作用；大于1时，提示药物间为拮抗作用，小于1时为协同作用。指数值越高，表示相互作用的强度越大，在图中表现为颜色越接近于红或蓝两端。X轴表示不同剂量浓度的U_当归（U_当归=当归实际用量/IC₅₀，_DG），Y轴表示不同剂量浓度的U川芎（U川芎=川芎实际用量/IC₅₀，_CX），Z轴表示归芎药对在不同剂量下的清除率，由X，Y，Z轴形成的三维空间区域表示不同比例当归-川芎药对的效应值形成的曲面图（局部截面图中参数所代表的是U_当归，U川芎，效应值强度，相互作用强度）。

2.4 归芎药对水提液的相互作用 在归芎药对水提液的响应曲面图1中A，协同作用范围窄，几乎成散点状分布，拮抗作用成条状分布，约6条，宽窄不一，大部分均未表现出明显协同与拮抗作用。图1中B（0.10，0.30，0.44，-1.00）的点作为协同作用最强的点，得质量浓度为0.59 g·L^-1，配比为1∶1.44。图1中C（1.00，20.00，0.76，1.00）的点作为拮抗作用最强的点，得质量浓度为26.82 g·L^-1，归芎配比为1∶9.56。

2.5 归芎药对醇提液的相互作用研究 在归芎药对醇提液的响应曲面图2中A，协同作用呈小条状分布，拮抗作用呈散点分布，而超过90%均未表现出明显协同与拮抗作用。图2中B（0.01，0.10，0.31，-1.00）的点作为协同作用最强的点，得质量浓度为0.12 g·L^-1，配比为1∶2。图2中C（0.40，0.10，0.80，1.00）的点作为拮抗作用最强的点，得质量浓度为1.64 g·L^-1，归芎配比为22.42∶1。

2.6 归芎药对先水提后醇提的相互作用研究 在归芎药对先水提后醇提液的响应曲面图3中A，协同作用呈小条状分布，有3条，拮抗作用呈散点分布，而超过50%均未表现出明显协同与拮抗作用。图3中B（0.10，1.70，0.62，-1.00）的点作为协同作用最强的点，得质量浓度为2 g·L^-1，配比为1∶10.76。图3中C（0.2，0.10，0.12，1.00）的点作为拮抗作用最强的点，得质量浓度为0.45 g·L^-1，归芎配比为1∶0.32。

3 讨论

近年来国内外研究表明，癌症、糖尿病、心脑血管等多种疾病与自由基导致的生物大分子氧化损伤有关。自由基是人体进行生命活动时产生的一种活性分子，在正常代谢过程中，自由基的产生和清除处于动态平衡，在某些病理情况下，这种平衡被打破，机体产生的自由基不能被及时消除，致使机体损伤，导致疾病发生。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为517 nm，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收减弱或消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，可用来检测自由基的清除情况，评价某物质的抗氧化能力。其能力用清除率来表示，清除率越大，表示抗氧化能力越强[20]。本实验采用DPPH法考察不同配比不同浓度不同提取方法的归芎药对抗氧化能力，然后应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数，建立三维响应面模型，应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。

结果显示，当归-川芎不同配比不同制法具有不同的抗氧化活性。通过分析响应曲面发现先水提后醇提的协同作用区域大于醇提液，水提液次之，可能是由于当归-川芎合并先水提后醇提能使更多抗氧化成分溶出增加。

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Study on antioxidant interaction of different preparations and

proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair

HUANG Mei-yan， TANG Yu-ping*， SHANG Er-xin， GUO Jian-ming， LIU Xin，

WANG Lin-yan， LI Wei-xia， DUAN Jin-ao

（Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Objective： To observe the in vitro antioxidant interaction of different preparations and proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair in the DPPH free radical scavenging rate with the response surface methodology. Method： The 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging rate method was adopted for determining the antioxidant activity of extracts from Danggui-Chuanxiong with 10 proportions and three extraction processes. The response surface methodology was used to determine the parameters of the dose-effect curve and establish a three-dimensional response surface model. The three-dimensional response surface graph was constructed with Matlab software. Result： All of the 30 samples with different proportions and preparations had antioxidant effect in scavenging free radicals and a remarkable dose-effect relationship. Their water extracts had a narrow synergistic range， with only spot distribution. Their antagonist ranges were districted in six bands of various widths. The synergistic ranges of ethanol extracts were districted in small bands， with the antagonist ranges scattered in points. The synergistic ranges of their water-alcohol extracts were distributed in three bands， with their antagonist ranges scattered in points. In short， the water-alcohol extracts showed a wider synergistic range than ethanol extracts， followed by water-extracts. All of the three extraction processes showed no obvious synergistic and antagonist effects. Conclusion： The quantitative study on the interaction of traditional Chinese medicines with different compatibilities with the response surface methodology provides reference of thoughts and methods for relevant studies.

[Key words] Danggui； Chuanxiong； drug pair； antioxidant effect； DPPH； response surface methodology； interaction

doi：10.4268/cjcmm20130218

[责任编辑 张宁宁]