张浩 郭治宇 胡桂英 周绍斌 许多嘉 施红旗 樊静 何忠平 金志刚吴波 洪毅 程俊峰 陆磊

下肢深静脉血栓形成合并肺栓塞小型猪模型的建立及评价方法

张浩 郭治宇 胡桂英 周绍斌 许多嘉 施红旗 樊静 何忠平 金志刚吴波 洪毅 程俊峰 陆磊

目的 初步探寻建立下肢深静脉血栓形成（DVT）合并肺栓塞（PE）的小型猪模型的方法。 方法 15只小型猪随机分为3组（A、B、C）。每组通过结扎双侧股静脉并注入氨甲苯酸以获得DVT模型，并经B超证实；3组实验猪分别于建模后第1、4、7天拆除双侧结扎线，并洗脱一侧股静脉内自体血栓后行CT血管造影（CTA）检查，若无肺栓塞影像学证据，则经头静脉注入体外制备的血栓后再次行CTA检查，7d后将小型猪处死并行病理学检查。 结果 2只小型猪因严重肺炎排除，其余13只中11只DVT合并PE建模成功并经病理证实，建模即刻成功率73．33%（7d后成功率53．33%），其中B组建模成功率为100%。其中11只DVT在B超上表现为股静脉腔内的条索状低回声；PE在CTA上表现为肺动脉主干或分支的充盈缺损及截断。病理检查示肺动脉内见混有明胶海绵和自体血栓的栓塞物。结论 下肢DVT合并PE小型猪模型可成功建立；B超和CTA检查可以较好的评价DVT和PE。

深静脉血栓形成 肺栓塞 CT血管造影 B超 小型猪

【 Abstract】Objective To establish a piglet model of deep venous thrombosis (DVT)and pulmonary embolism(PE)．Methods The deep venous thrombosis was induced in 15 piglets by ligation of bilateral femoral vein and injection of aminomethylbenzoic acid,the DVT was confirmed by ultrasonography．DVT model piglets were randomly divided into 3 groups (n=5 in each),the ligation of femoral vein was released after 1d(group A),4d(group B)and 7d(group C),respectively．Then autologous blood clots of one side of the femoral vein were flushed and the lungs were examined with CT angiography(CTA)scan．If there was no evidence of pulmonary embolism,in vitro prepared autologous blood clots and gelatin sponge were injected through the cephalic vein to induce the PE;and the established DVT and PE were confirmed by CTA．The piglets were sacrificed after 7d,and the pathological examinations were performed．Results The DVT and PE were successfully induced in 11 piglets with the success rate of 73．3%(53．3%after 7d),while the success rate in group B was 100．0%．The DVT was presented on ultrasonography as endovenous strip-like hypoechoic foci．The presentation of PE on the CTA was filling-defect and truncation of the pulmonary trunk or branch．Pathological examination revealed pulmonary emboli mixed with gelatin sponge and autologous blood clots．Conclusion The piglet model of DVT and PE has been successfully established,which can be confirmed by ultrasonography and CTA．

【 Key words】Deep venous thrombosis Pulmonary embolism Computed tomographic angiography B-mode ultrasound Piglet

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）是指内源性或外 源性栓子阻塞肺动脉及其分支引起急性肺循环功能障碍而导致的一系列临床综合征。下肢深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）形成是目前公认的肺栓塞最常见原因，国外报道90%左右肺栓塞的栓子来自于下肢深静脉[1]。DVT合并PE若不经治疗，据文献报道[2]临床病死率达30%以上。而及早诊断及治疗，可将病死率降至10%[3]。近年来关于DVT或PE的实验动物模型研究有了较大发展，但DVT-PE的动物模型研究较少，建立DVT合并PE的动物模型对研究其病理生理过程有重要意义，本研究尝试建立DVT合并PE的小型猪模型，进一步了解DVT合并PE的病理生理过程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 实验用小型猪为普通级广西巴马小型猪，由上海市农业科学院提供[动物许可证号：SCXK（沪）2010-0025]，月龄5～6个月，体重（20±2.5）kg，共15只，其中雌性8只，雄性7只，健康无肺炎。饲养于金华市食品药品监督所实验动物基地，饲料为502专用仔猪料（郑州利源饲料有限公司）。

1.1.2 主要设备及仪器 CT机（德国西门子16排螺旋CT）；彩色多普勒超声(荷兰 Philips iu22)；氨甲苯酸（常州康普药业有限公司10ml/支）；氯胺酮（福建古田药业有限公司，2ml/支）；丙泊酚（西安力邦制药有限公司，50ml/瓶）；戊乙奎醚（成都力思特制药股份有限公司，1ml/支）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将15只小型猪随机分为A、B、C 3组，每组5只。

1.2.2 动物麻醉与监测 麻醉前测动物体重，以戊乙奎醚0.02mg/kg+氯胺酮8mg/kg于颈后部肌内注射进行基础麻醉，约5～10min小型猪自行卧倒，将其仰卧固定在实验手术台上，给予面罩吸氧（氧流量5L/min）。然后于一侧耳缘静脉套管针穿刺输液，输注乳酸林格液8～10ml/（kg·h）补充基础和禁食所需。其中8只采用丙泊酚5mg/（kg·h）+氯胺酮5 mg/（kg·h）麻醉维持，其余7只采用氯胺酮8～10 mg/（kg·h），实验过程中如果实验猪有明显体动可追加氯胺酮1mg/kg。实验中全程用便携式氧饱和度仪监测猪耳部氧饱和度和心率，肉眼观察呼吸（腹部起伏频率）。

1.2.3 模型建立 通过结扎双侧股静脉约2～3cm，并注入止血药物氨甲苯酸注射液0.1ml制作DVT模型。同时穿刺股动脉抽取动脉血19ml+氨甲苯酸注射液1ml，静置冰箱，保持温度3～4℃，体外制备混合性血栓。A组术后24h打开双侧腹股沟切口，探查股静脉有无血栓形成。洗脱一侧股静脉血栓后行CTA检查，了解有无肺动脉栓塞。若无肺动脉栓塞则经一侧前肢头静脉切开插管，将明胶海绵2块（2.0cm×1.0cm×0.5cm）及体外制备的混合性血栓注射入上腔静脉，使之随血流经过心脏后泵入肺动脉导致肺动脉栓塞。再次行CTA检查有无肺栓塞。B组于股静脉结扎术后4d，C组于股静脉结扎术后7d行相同操作。

1.2.4 B超检查 术前检查双侧股静脉血栓形成情况及拆除结扎线后股静脉血栓的情况。

1.2.5 CT血管造影（computed tomographic arteriography，CTA）检查 猪麻醉成功后平放CT机，经静脉套管连接高压注射器。通过耳朵放置经皮血氧饱和度监测仪，实时记录心率和血氧饱和度情况。先行胸部CT平扫检查，了解肺部有无炎症等情况。洗脱一侧血栓，采用37g/100ml碘海醇注射液行CTA检查，注射剂量1.5mg/ kg，注射速度4ml/min，摄片延迟18s采集动脉增强期肺动脉影像。10min后经预置的前肢头静脉硅胶管注入明胶海绵2块及体外制备的混合性血栓20ml，同时观察血氧饱和度和心率变化情况，若出现血氧饱和度＜90%和心率增快10%～20%左右变化，提示PE成功可能，立即再次行CTA检查确认是否成功。

1.2.6 大体解剖 PE模型制备成功后7d处死小型猪，迅速解剖，完整分离心肺。沿上腔静脉-右心房-右心室-肺动脉主干-肺动脉左右分支-肺叶动脉-肺段动脉-各分支小动脉顺序依次切开，肉眼观察动脉内有无血栓。

1.2.7 病理学检查 病变肺组织标本用4%甲醛液固定后送我院病理室行病理学检查，采用HE染色。

1.3 统计学处理 采用StataSE 11.0统计软件，组间率的比较采用χ2检验及Fisher精确检验。计量资料首先进行峰度及偏度检验，对于正态分布的计量资料以表示，其组间值比较采用独立样本的t检验，非正态分布资料采用秩和检验。

2 结果

实验过程中，2只小型猪因严重肺部感染中途退出实验（A、C组各1只），其余13只小型猪全部按计划完成实验。

2.1 DVT模型

2.1.1 DVT建模成功率 完成实验的13只小型猪DVT模型均建模成功（即刻成功率86.7%）。其中A组保留时间短，7d后复查B超股静脉血栓均消失，而B、C组血栓在7d后复查均存在（7d后建模成功率60.0%）。

2.1.2 DVT的大体解剖 A组于1d后拆除缝线，局部无明显粘连，含有血栓的血管解剖清晰，易于分离，洗脱容易，手术时间短，手术时间为（143.75±4.79）min。7d后复查B超DVT消失，解剖亦未发现DVT，提示1d形成的血栓较易溶解（0/4）。B组于4d后拆除缝线，局部少许粘连，含有血栓的血管解剖清晰，较易分离，洗脱较容易，手术时间短，手术时间为（139.00±11.94）min。7d后复查B超及解剖均可见DVT(5/5)。C组于7d后拆除缝线，局部粘连致密，含有血栓的血管解剖及分离困难，洗脱困难，手术时间长，手术时间为（163.75±4.79）min。7d后复查B超及解剖仍可见DVT(4/4)。A组与B、C组比较，7d后DVT存留均有统计学差异（均P＜0.05）。A、B组与C组比较，手术时间均有统计学差异（均P＜0.05）。提示4、7d后形成的血栓较稳定。而B组形成的血栓稳定且解剖相对容易，更适合DVT建模。见图1。

图1 DVT大体解剖[A：股静脉血栓（箭头所示）；B：血栓停留在右心房（箭头所示）]

2.1.3 B超对DVT的评价 DVT在B超上表现为股静脉腔内的条索状低回声，见图2。本次实验13只小型猪在术前经B超判断有无DVT，然后经过解剖证实，两者符合率为100.0%（13/13，9/9，4/4）。提示B超对小型猪DVT有较好的评估价值，见表1。

图2 DVT的B超表现

表1 B超及解剖诊断DVT的对照（只）

2.2 DVT-PE模型

2.2.1 DVT-PE建模成功率 13只小型猪应用自体血栓洗脱方法均未能在CTA上发现PE，而加用注射体外混合性血栓的方法，其中11只术后即刻和术后7d均可在CTA上发现典型的PE影像学表现（即刻和7d后建模成功率均为73.3%）。A组中1只小型猪未在CTA上发现PE，而大体检查发现有PE，而C组1只小型猪血栓停留在右心房中，见图1B。洗脱血栓与洗脱血栓+体外注射混合性血栓两种方法比较，具有统计学差异（P＜0.01），见表2。结合DVT的成功率，DVT-PE总建模成功率为53.3%。其中A组的DVT-PE建模成功率为0.0%，C组为60.0%，而B组的则高达100.0%。

表2 洗脱单侧肢体血栓与体外注射血栓合剂对照（只）

2.2.2 小型猪生命体征变化 洗脱自体血栓后，小型猪生命体征（心率及血氧饱和度）均无明显变化。而在注射体外制备混合性血栓后即刻，小型猪出现心率增快，血氧饱和度下降，持续约30～60min后可基本缓解。注射前10min心率为（141.46±5.61）次/min，血氧饱和度为（92.23±1.24）%，而注射后心率为（171.54±16.82）次/min，血氧饱和度为（80.31±4.23）%，两者比较具有统计学差异（P＜0.01）。

2.2.3 CTA对PE的评价 PE在CTA上表现为肺动脉主干或分支的充盈缺损或截断，见图3。13只小型猪中，11只术后7d在大体解剖和病理学检查上均能发现PE，1只未在CTA发现，但大体检查可发现有PE。另外1只血栓停留在右心房中，未进入肺动脉。CTA评价小型猪PE模型的敏感性为91.7%，特异性为100.0%，与病理学检查所见对照见表3。

2.2.4 病理学检查 病理学大体及镜下检查示肺动脉内见混有明胶海绵和自体血栓的栓塞物，同时还可发现肺的炎症反应，见图4-5。

3 讨论

PE临床并不少见，如不治疗病死率较高，而其最常见原因为下肢DVT，因此建立一种DVT合并PE的动物模型对其病理生理过程研究有重要意义，本研究成功建立了小型猪下肢DVT合并PE的动物模型，为今后进一步研究奠定了基础。

3.1 实验动物的选择 文献报道目前建立PE的动物模型常选择兔、鼠、犬、猪等[4]，相比于前3者，本研究选择以小型猪为实验动物，鉴于小型猪各器官系统在种属进化方面与人类更为接近，易于饲养，习性较为温顺，不具有攻击性，且体积适宜，实验操作相对简单。同时小型猪肺叶结构发育较好，肺组织厚度适宜[5]且肺组织受支气管动脉及肺动脉双重血供，代偿能力较强，不易因建立PE模型而发生猝死。麻醉相对简单，容易控制；模型建成后易经CT或B超客观评价；且经前期实验发现小型猪下肢血管容易暴露，易于操作，自身抗感染能力较好；但小型猪模型制作成本相对昂贵。

图3 CTA对PE的评价[A：正常肺CTA；B：PE CTA（箭头所指）；C：正常肺CTA冠状面；D：PE CTA冠状面（箭头所指）]

表3 CTA和病理学检查对PE的评价（只）

图4 PE的大体检查[A：左肺动脉开口处血栓（箭头所指）；B：血栓呈分叉骑跨状（箭头所指）]

图5 PE的镜下检查[A：肺血管血栓（箭头所指）；B：血栓及明胶海绵混合物（箭头所指），HE染色，×100]

3.2 血栓制备及建模方法 预实验发现单纯通过体内自体血栓洗脱的方式获得的栓子量较少，在CTA上未能发现典型的PE表现。故本研究加用体外注射栓子的方式，即先取小型猪自体血加入氨甲苯酸制成自体血凝块并混有明胶海绵以形成体外混合性血栓，而所用明胶海绵微粒直径3.8～4.2mm，近似于人类亚段肺动脉直径，能随意裁剪形状，且无抗原性，栓塞血管后易促使血栓形成，获得相对稳定的动物模型[6-7]；利用硅胶管经小猪头静脉插入15cm（约至右心房），通过体外注入混合性血栓20ml，经CTA证实成功建成DVT-PE模型。

文献报道DVT建模后的第1、4、7天分别有红色、混合、机化血栓形成[8-9]，而红色血栓软易脱落，且易被动物体内的纤溶系统溶解；机化血栓因与血管壁粘连致密，不易脱落形成栓塞，这与本研究过程中发现DVT建模后第4天血栓形成较为牢固并且解剖相对容易一致。

选择小型猪浅静脉（头静脉）切开插管，相比经颈内静脉切开或下腔静脉置管注入血栓有以下优点：头静脉体表位置表浅，只需切长约0.5～1.0cm小切口即可；且粗细适宜，可植入外径约4.0mm，内径约3.0mm的橡胶管，满足对血栓输注的要求；至右心房距离短，只需插管约15cm即可达到右心房，减少了血栓在血液循环过程中的损耗；操作过程创伤小，术后恢复快。

3.3 模型评价方法 DVT模型可通过血管B超检查发现股静脉腔内索条状低回声得以确认，而本研究主要评价增强螺旋CT对PE诊断的敏感性；目前已有实验[10-12]以病理检查为金标准，探讨核素肺灌注显像、增强螺旋CT及数字减影肺动脉造影对猪急性PE实验模型（相当于人类亚肺段水平PE）的影像学特点，结果显示核素肺灌注显像对猪肺段（相当于人类亚肺段）PE的探测优于增强螺旋CT，是目前首选的检查手段；而后者对栓子定位优于前者；数字减影肺动脉造影对猪肺段PE诊断能力最强，但有创故应用受限。本研究预实验曾仔细解剖过小型猪的肺标本，对猪肺血管走形相对熟悉，且明胶海绵堵塞猪肺动脉能形成的自远而近亚段以上的栓子。实验中15只小型猪中11只，在CTA上能较明显发现肺动脉内完全或不完全的充盈缺损，特异性100%，故笔者认为CTA对猪PE模型的评价敏感性相对较高；如小型猪在CT检查过程中改用球囊辅助通气以消除自主呼吸所致的伪影，并结合多排螺旋CT，缩短扫描时间，能最大程度降低假阳性或假阴性率。

综上所述，此方法建立的DVT-PE模型稳定可靠，能模拟PE的病理生理过程，可用于各类药物实验和外科实践，比如可用于评估溶栓药物对肺动脉血栓和下肢深静脉血栓的溶解效能，也可用于肺动脉和下肢静脉取栓术、肺动脉血栓抽吸术等，值得推广和进一步研究。

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Establishment of deep venous thrombosis and pulmonary embolism model in piglet

2012-11-14）

（本文编辑：胥昀）

浙江省科技厅浙江省实验动物科技计划项目（2009F80002）

321000 浙江大学金华医院（金华市中心医院）血管外科（张浩、郭治宇、金志刚、吴波、洪毅、程俊峰、陆磊），麻醉科（胡桂英、许多嘉），影像科（周绍斌），超声科（樊静），病理科（施红旗）；金华市食品药品监督所（何忠平）

郭治宇，E-mail：zhiyuguo@sohu.com