唐铭霞，何卫，胡建军，王克秀，王余明，刘冬

（四川省农业科学院作物研究所，四川成都610066）

利用分子标记鉴定四川省马铃薯品种

唐铭霞，何卫*，胡建军，王克秀，王余明，刘冬

（四川省农业科学院作物研究所，四川成都610066）

以15个马铃薯育成品种和引进品种为材料，采用微卫星分子标记技术鉴定供试马铃薯品种。研究检测了4个SSR位点在15份马铃薯育成品种（系）中的多态性。在15份马铃薯品种（系）中，共检测到等位基因26个，每对引物检测到的等位基因个数最少为5个，最多为10个，平均6.5个。PIC（Polymorphism information content）值最高为0.9288；最低为0.8597，平均PIC值为0.8857。仅利用少数几对高PIC值的SSR引物，即能将全部供试品种（系）区分，因此，SSR技术有利于高效准确的鉴定马铃薯品种。

SSR；马铃薯；品种鉴定

随着马铃薯产业的发展，对育种提出了更高的要求。在育种实践中，传统鉴定方法主要采取形态比较，但由于受环境及主观因素的影响而效率较低。另外，由于现代育种研究中的新品种多由数量有限的一些优良品种作亲本杂交育成，新品种遗传基础狭窄，品种之间的形态学差异越来越小，造成可供品种鉴定利用的形态性状不足，增加了品种鉴定的困难。分子标记反应DNA水平遗传差异，与传统鉴定方法相比，在种质资源的鉴定、评价以及种质资源遗传多样性分析等方面具有较大优越性。

SSR分子标记技术目前已经在多个领域得到应用，它的一个重要潜在应用领域是品种鉴定和品种产权保护。新品种获得品种权的重要前提是具备特异性，即明显不同于同一物种内的所有其他品种。为便于品种间的比较，要求测试数据易于保存、处理和交流。目前SSR标记在国外已应用于部分农作物的品种产权保护。

研究采用SSR分子标记法进行马铃薯品种鉴定，有效解决马铃薯品种混杂和品种鉴定等问题，对于马铃薯生产、加工、育种、常规检验以及种质资源保护等都具有非常重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 验试材料

供试材料来源于四川省农业科学院的15个栽培品种，见表1。

表1 15份马铃薯材料的名称与来源Table 1 The name and origin of 15 potato cultivars

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取采用改良CTAB法提取马铃薯新鲜叶片总DNA。稀释到20~100 ng/μL，并置于4℃保存备用。1.2.2 SSR基本程序扩增反应的试剂与仪器

使用Eppendorf PCR仪，Taq酶和dNTPs购于TAKARA生物产品有限公司。

根据徐敏[1]研究结果，反应总体积为20 μL：模板DNA 50 ng，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，4.0 mmol/L MgCl2，400 μmol/L dNTPs，0.8 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶1 U，用双蒸水调整终体积至20μL，最后加15μL石蜡油覆盖。

反应程序如下：94℃预变性2 min，然后94℃变性30 s，Tm复性45 s，72℃延伸45 s，进行35个循环，最后于72℃延伸10 min，缓慢冷却至4℃下保存。引物共4对[2,3]，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR结束后，在6%聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，凝胶电泳在北京六一的DYY10C型电泳仪上进行。电泳结束后，将胶板用银染法显影。

1.2.3 多态性信息量的计算

按照Anderson等[4]的方法。参照Harker等[5]，对于同一SSR引物扩增出几个片段且位点个数不明的情况，仍作为一个位点计算，无效等位基因（Null allele）作为一个等位基因，根据Smith等[6]的公式计算多态性信息量（Polymorphism information content, PIC），即PIC=1-Σfi2，其中f为i位点的基因频率。采用Nei和Li[7]的方法计算遗传相似系数：GS=2Nxy/ (Nx+Ny)，式中Nx代表x的总带数，Ny代表y的总带数，Nxy为两个体x、y共有的条带数。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

从170对SSR引物中筛选出4对多态性较高、分辨率较高、带型清楚的引物。其引物序号分别为STM1052，StI002，StI012和StI057。表2为筛选出的4对引物。为评价不同引物的品种鉴别力，计算了4对引物的PIC值，以StI057最高，为0.9288；其次StI012，为0.8896；最低的是STM1052，为0.8597（表2）。4对引物的平均PIC值为0.8857。

表2 试验所用SSR引物Table 2 SSR primers used in this experiment

2.2 品种区分鉴定

利用4对引物对15份马铃薯品种进行扩增，所有品种均能扩增通过SSR引物扩增出的谱带，可以将全部供试马铃薯品种区分开。例如：引物StI012可以完全区分15个样品中的6个样品，而引物STM1052可以将引物StI012区分不开的四组完全区分开来，StI002和StI057组合也可完全区分所有供试品种。15个样品遗传相似度见表3。

表3 15个样品遗传相似度Table 3 Genetic similarity of 15 samples

3 讨论

分子标记技术作为一种新的品种资源鉴定技术要应用于生产实际,应该满足稳定性好、分辨率高、多态性强、效率高和方便快捷。SSR标记是继RAPD标记后出现的基于PCR反应的DNA标记技术，SSR标记结果稳定，重复性好，因此SSR反应体系利于在实验室间进行交流[8]。

利用SSR技术进行品种鉴定的方法是稳定可靠的。随着分子标记技术的不断发展和完善，SSR技术将在DNA水平上鉴别不同品种是否存在差异,从而科学、准确地判断特定品种的特异性、一致性和稳定性，为保护育种、鉴定和检测马铃薯品种真实性提供客观、科学和准确的技术保障。

四川作为马铃薯栽培重要省份,长期栽培驯化，已经培育出很多新品种。本研究将四川省引种和培育的马铃薯品种进行鉴定区分。结果表明，仅利用几个高PIC值的SSR位点，就能够将参与试验的全部品种区分。在马铃薯育种中，品种的选育集中在产量、品质、抗逆、抗病等性状上，这使得部分与上述性状连锁的SSR位点多态性大大降低。但在马铃薯基因组中仍存在着大量与上述性状未发生连锁或者连锁不紧密的SSR位点，利用这部分SSR位点的多态性则可以将选育的品种区分。因此，利用SSR标记高效准确的进行马铃薯品种鉴定是完全可行的。

[1]徐敏.中国马铃薯审定品种系谱分析及遗传多样性研究[D].北京：中国农业科学院,2007.

[2]Ghislain M,Spooner D M,Rodriguez F,et al.Selection of highly informative and user-friendly microsatellites(SSRs)for genotyping ofcultivated potato[J].Theor ApplGenet,2004,108:881-890.

[3]Feingold S,Lloyd J,Norero N,et al.Mapping and characterization of new EST-derived mirosatellitesforpotato(Solanum tuberosum L.)[J]. Theor Appl Genet,2005,111:456-466.

[4]Anderson JA，ChurchillGA,Autrique JE,etal.Optimizing parental selection for genetic linkage maps[J].Genome,1993,36:181-168.

[5]Harker N,Rampling L R,Shariflou M R,et al.Microsatellites as markers for Australian wheat improvement[J].Aust J Agric Res, 2001,52:1121-1130.

[6]Smith JS C,Chin E CL,Shu H,etal.An evaluation ofthe utility ofSSR loci as molecular markers in maize(Zea mays L.):comparisons with data from RFLPS and pedigree[J].Theoretical and Applied Genetics, 1997,95:163-173.

[7]Nei M,Li W.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76(10):5269-5273.

[8]匡猛,杨伟华,许红霞,等.分子标记技术在棉花品种鉴定上的研究进展[J],棉花学报,2009,21(4):330-334.

Identification of Different Potato Cultivars(Solanum tuberosum L.) in Sichuan Province with Molecular Markers

TANG Mingxia,HE Wei＊,HU Jianjun,WANG Kexiu,WANG Yuming,LIU Dong
(Crop Research Institute,Sichuan Academy of Agriculture Sciences,Chengdu,Sichuan 610066,China)

Fifteenpotato cultivars(lines)wereidentifiedusing microsatellitemolecularmarkertechnology.Polymorphismof fourSSRlociin the fifteen potato cultivars(lines)was examined in this research.In the fifteen potato cultivars(lines),26 alleles in total were detected,ranging from 5 to 10 per set of primer pairs,with an average of 6.5.The polymorphism information content (PIC)value of SSR loci varied from the lowest of 0.8597 to the highest of 0.9288,averaging 0.8857.A few SSR primers of high PIC value could distinguish all cultivars in this research.Therefore,SSR technology could be used to identify potato cultivars (lines)efficiently.

SSR;Solanum tuberosum;cultivar identification

S532

A

1672－3635（2013）01-0006-03

2012－12－31

四川省马铃薯育种攻关项目（2011NZ0098－4）。

唐铭霞（1982-），女，助理研究员，主要从事马铃薯生物技术及组培研究。

何卫，主要从事马铃薯栽培生理生态和抗病遗传育种等研究，Email：hewei2008@yahoo.com.cn。