李奕平 王潇

免疫应答主要分为先天性免疫和获得性免疫。与获得性免疫系统相比，先天免疫不需要基因重组，它的多样性依赖于若干先天免疫基因，它们的接合变异型编码在宿主基因组中［1］。先天免疫可以对病原体作出快速应答，并起防御第一道防线的作用。先天免疫系统通过模式识别受体（Patten recagnition receptors，PRRs）识别病原体，模式识别受体可以检测到保守的微生物成分——病原体相关分子模式（Pathogen associatedmoleculal patterns，PAMPs）。先天免疫系统由几种模式识别受体组成，包括Toll样 受 体（Toll-like receptors，TLRs），NOD样 受 体（NOD-like receptors，NLRs）和RIG-1样受体（RIG-1like receptors，RLRs）。TLRs在细胞表面和核内体识别细菌，而NLRs 和RLRs在细胞溶质中检测细菌成分。哺乳动物TLRs可以感受细胞表面及核体中由细菌引起和自身配体引起的大量炎症。近期的研究发现核苷酸结合寡聚化结构域NLRs可以在细胞内识别PAMPs。这一细胞溶质PRRs的发现说明一些回避胞外检测的细菌在宿主细胞溶质中可被另一条识别路线所识别［2-4］。

1 NLR家族

NLR蛋白家族是细胞内PRRs中的一个大家族，这类蛋白质的特征是带有一个被称作NACHT（或NBD/NOD）的中央寡聚化结构域［5］。NLRs是哺乳动物先天免疫系统的重要组成部分，充当细胞内受体，检测病原体和组织损伤引起的内因性分子加工。这个家族也被称为CATERPILLER，NOD，NACHTLRR或NOD样受体［6］。NLRs蛋白家族中，蛋白质的一般结构域包括一个N末端效应器结合区域，这一区域由蛋白质-蛋白质相互作用结构域组成，如半胱天冬酶补充结构域（CARD），热蛋白结构域（PYD）和杆状病毒抑制重复序列结构域。此外，还有一个中央NOD结构域和大量C末端富含亮氨酸重复序列，中央NOD结构域对核酸结合和自我寡聚化非常重要，而C末端富含亮氨酸重复序列用来检测保守的微生物模式和调节NLR活性［7-9］。

NLR蛋白是一个多样的蛋白质家族，以N末端结构域为基础，NLRs可以分成3个亚家族，也被称 CARD-containing NODs、PYD-containing NALPs和BIR-containing NAIPs［2］。NLRs 涉及多种信号通路的激活，对各种各样的微生物群体具有特异性，从而控制宿主——病原体的交流。NLRs与其同源激动剂的结合可以启动一个信号级联反应，最终导致核转录因子κB（NF-κB）的上流调节和促炎性细胞因子的产生。不同于大多数PRMs，NLRs是细胞内微生物传感器，在宿主细胞质隔间中识别确定的微生物产物。

NLR蛋白的激活导致由NF-κB、MAPK或半胱氨酸天冬氨酸酶激活介导的炎症反应［10］，连同其家族分泌物也与炎症疾病有关，说明这些分子在维持宿主-病原体相互作用和炎症反应中有重要作用。因此，理解NLR的信号对各种各样传染性和炎症性疾病的治疗性干预很重要。迄今为止，已经知道可识别细菌的细胞壁成分，IPAF 和NAIP识别细菌的鞭毛蛋白，NALP1显示可检测炭疽致死毒素［7］。这里，我们主要讨论NOD1和NOD2的识别途径以及与炎性疾病的关系。

2 NOD1与NOD2

NOD1和NOD2蛋白是哺乳动物NLR家族中最先发现的细胞内微生物传感器，它们都是NLRs家族CARD亚家族中的成员，NOD1包含一个单一CARD结构域，NOD2在N末端包含两个CARD结构域［8］。

细菌通过它们细胞壁的结构和肽聚糖（PG）层的厚度被分为革兰色阳性和革兰氏阴性菌，革兰色阳性菌肽聚糖层厚，革兰色阴性菌肽聚糖层薄。NOD1和NOD2蛋白可识别细菌细胞壁的肽聚糖（PG）成分，但是其识别的基序是不一样的。NOD1识别N-乙酰葡糖胺胞壁酸二糖，其识别的最小的成分是g-D-glutamyl-meso-DAP，与一个末端氨基酸是中央二氨基庚二酸（mDAP）的三肽结合，mDAP是多数革兰氏阴性菌细胞壁的成分（11）。人类NOD1对肽聚糖三肽结构的识别是高度特异的，连接在mDAP上的一个附加氨基酸就可以使NOD1对这种细菌产物的检测失效。此外，肽聚糖基序的识别具有寄主专一性，如人的NOD1识别L-alanine-g-D-glutamatemeso-DAP，而鼠科的NOD1特异性识别四肽结构L-alanine-D-glutamate-meso-DAP-D-alanine 基序［11，12］。

NOD2可识别胞壁酰二肽（MDP），胞壁酰二肽的组成元素为NAM-L-Ala-D-Glu，是一种革兰氏阴性菌、阳性菌细菌肽聚糖共有的成分，这说明NOD2可抵御多种细菌。NOD2可以从大量革兰氏阳性和革兰氏阴性热杀细菌和细菌提取物中感受肽聚糖。细菌MDP可以释放，且在细胞壁通过细菌水解酶作用生物合成时，或通过宿主溶解酶素降解摄取的细菌后，易于靠近 NOD2［11，13］。NOD2对某些机体有特异性，并不是所有含有大量肽聚糖成分的细菌种类都有强烈的NOD2刺激活动。NOD2配体识别具有立体专一性，如被NOD2识别的是MDP-LD，而不是MDP-LL 或MDP-DD形式。

3 NOD1和NOD2与炎性疾病

在NOD蛋白应答细菌和细菌产物作用的研究中发现，NF-κB激活是这些蛋白产生促炎功能的重要途径。NF-κB一旦被激活，NOD1 和NOD2通过CARD-CARD 相互作用补充 Rip2［14］，Rip2是一个丝氨酸——苏氨酸激酶。有试验证明依赖NOD1 和NOD2的NF-κB激活在缺乏Rip2的小鼠胚胎成纤维细胞中被消除，但在添加Rip2之后会恢复，证明了NOD1 和NOD2信号通路下游中Rip2的作用。Rip2的齐聚反应导致κB激酶复合体的激活，随后释放，同时激活NF-κB的核转位。NOD2的激活同样诱导NEMO的泛素化，这个过程与推动特殊NF-κB应答有关。

除了NF-κB途径，NOD1和NOD2还可以激活其他先天免疫反应。例如，NOD2的NACHT和LRR在与线粒体外膜蛋白MAVS的联系中是非常重要的［15］，MAVS是一个与先天免疫应答RNA病毒有关的衔接蛋白，MAVS复合体刺激IRF的激活，诱导类型1 IFN应答［16］。NOD2与MAVS的相互作用诱导IRF3的激活和IFNβ的产生。此外，通过一种依赖TBK1和IKKε的机制，NOD1和NOD2的激活可以诱导含RIP2 和TRAF3的蛋白复合体的形成，导致IRF7的激活和IFNβ的感应。事实上，由幽门螺旋杆菌引起的感染可以通过一种依赖NOD1和NOD2的机制激活一个类型1 IFN应答，导致Stat1激活和进一步的细菌装载的清除［15，17］。

NOD1 和NOD2还可以增强自我吞噬作用，自我吞噬是通过溶酶体介导的破坏过程，是细胞内微生物移除的一个重要过程［18-20］。NOD1 和 NOD2激动剂可以诱导体外和体内的自我吞噬作用。NOD1和NOD2蛋白都可与ATG16L1相互作用，且都与ATG16L1 共集中在细胞质膜上［15，20］，ATG16L1 是类泛素系统的重要组成，类泛素系统在自噬体的形成中很重要。NOD1通过自我吞噬限制细菌装载，用Shigella flexneri感染之后，缺乏NOD1的细胞与野生型细胞相比，细胞内的细菌含量更高［20］。

基因中编码NOD1 和NOD2的遗传多态性被越来越多的与慢性炎性疾病联系起来。NOD1和NOD2在炎性疾病中的潜在作用已经通过一系列动物模型的调查揭示出来。

许多活体内的研究已证明NOD1和NOD2在宿主防御中的作用。例如，NOD1 和 NOD2都能促进细胞内病原体肺炎衣原体从肺中的清除。Nod1-/-和Nod2-/-的老鼠会延迟清除肺部细菌且iNOS的表达及NO的产生有缺陷，说明NOD1 和 NOD2可识别C.pneumoniae。NOD1与宿主抵御多种病原菌联系在一起，肽聚糖的成分meso-DAP（NOD1激动剂）可以通过NOD1激活人体上皮细胞来分泌抗菌因子和细胞因子［21］。同样，NOD2能检测细胞外的细菌如金黄色葡萄球菌和细胞内的原生动物如刚地弓形虫，被认为是宿主免疫的重要分子。

许多研究证明，缺乏TLRs的肠细胞中致病菌的识别依赖NOD1的激活，与NOD2相比，在人感染革兰氏阴性肠原杆菌的单层上皮细胞中，NOD1对激活NF-κB是必要的“储备机制”，这种肠原杆菌可以逃避TLR的感应。NOD1也可充当NOD2的储备。例如，在缺乏NOD2的巨噬细胞中，NOD1激动剂完全有能力刺激细胞因子如TNFα和IL-6的分泌，诱导 NF-κB 和 MAPK 激活［10，22］。

NOD2的表达可使膜上皮细胞对细菌产物敏感，增强趋化细胞因子IL-8和防御素的释放［22］。缺乏NOD2的老鼠的对cytoinvasive Listeriamonocytogenes引起的口腔感染高度易感。因而，在维持肠道屏障功能，抵御细胞病原体完整性时，NOD2被认为充当了分子哨兵的作用［23，24］。

越来越多的研究表明NOD1 和NOD2信号的异常会引起或造成各种各样的人类疾病。遗传研究表明，一些NOD2变体与克隆式疾病（CD）的易感性有关［25］，CD是人类慢性复发缓解型炎症性肠病，特征是回肠末端内部特殊的穿壁性炎症，以间断的方式影响整个肠胃［23，25］。常见的NOD2突变的个体纯合子或混合杂合子有大约20倍的发病风险［26］，而杂合个体只有两倍的风险。生物化学和功能研究显示，人类与CD相关的NOD2变体在应答MDP时激活NF-κB的能力会下降或缺失，但对LPS激活仍维持正常应答［27，28］。此外，从CD病人中分离出的单核细胞或健康个体的纯合子、常见NOD2突变的混合杂合子在MDP刺激后，TNFα、IL-6、IL-10和 IL-1β等炎性细胞因子的分泌减少。与CD相关的NOD2突变在MDP识别的选择性损伤中可引起功能失活的表现型。

NOD2编码基因的错义突变还与Blau综合征的发病有关［26］。Blau综合征是一种常染色体显性遗传病，临床上主要表现为不依赖病原微生物刺激的无菌性炎症，其发病相关基因位于16号染色体，与NOD2基因相邻NOD2编码基因的错义突变引起NF-κB持续活化，导致炎症的产生［29］。此外，NOD2多态性与EOS综合征的发病也有关系［30］，EOS在许多情况下可引起严重的并发症，如破坏性的关节病或失明，EOS综合征与Blau综合征遗传病理相同，均是由于CARD15突变引起NF-κB激活［30，31］。

4 展望

过去几年里在对NLR蛋白功能的理解中取得了显著进展。一些NLR蛋白介导宿主对病原体感应器的应答，可以在病原体入侵期间调节炎性反应。NLR信号引起NF-κB，MAPK和caspase-1的激活，从而引起炎性细胞因子，趋化因子和抗菌分子的感应。迄今为止，NOD1 和 NOD2是NLR家族蛋白中研究得最深入的。关于这些蛋白的试验研究给我们提供了在宿主抵御和炎性疾病中这些先天免疫蛋白多种作用的理解。

然而，许多关于NLR蛋白功能的问题还没有解决。调节NOD1/NOD2活性的细胞机理仍有待研究，同样，一些下游与NOD信号复合体有关的事件如NF-κB，应力激酶，IFN应答，自我吞噬和其他过程的激活也有待研究。重要的是，NOD1 和 NOD2药理学调制的治疗方法大部分仍未开发。其中一个关键问题是NOD1 或 NOD2的活性是否可以被有效的抑制而不会对宿主抵御内源性微生物和病原微生物造成过度损伤。除此之外，还有许多问题有待解决，如NOD1和NOD2之间是否存在相互作用；它们与其他天然免疫受体又通过怎样的作用机制共同调节天然免疫和特异性免疫。对这些问题的回答将为我们研究人类抗感染、抗肿瘤和探索相关疾病的防治提供新的切入点。

［1］ Bergboer JG, Zeeuwen PL, Schalkwijk J.Genetics of psoriasis：evidence for epistatic interaction between skin barrier abnormalities andimmune deviation［J］.Invest Dermatol, 2012, 132（10）：2320-2321.

［2］ Kanneganti TD, Lamkanfi M, Núñez G.Intracellular NOD-like receptors inhost defense and disease［J］.Immunity, 2007, 27（4）：549-559.

［3］ Akira S.Innate immunity and adjuvants［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2011, 366（1579）：2748-2755.

［4］ Monie TP, Bryant CE, Gay NJ.Activating immunity：lessons from the TLRs and NLRs［J］.Trends Biochem Sci, 2009, 34（11）：5553-5561.

［5］ Inohara N, Nunez G.Cell death and immunity：NODs：intracellular proteins involved in inflammation and apoptosis［J］.Nat Rev Immunol, 2003, 3：371-382.

［6］ Ye ZM, Ting JPY.NLR, the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing gene family［J］.Curr Opin Immunol, 2008, 20（1）：3-9.

［7］ Wilmanski JM, Petnicki-Ocwieja T, Kobayashi KS.NLR proteins：integralmembers of innate immunity andmediators of inflammatory diseases［J］.Leukoc Biol, 2008, 83（1）：13-30.

［8］ Proell M, Riedl SJ, Fritz JH, et al.The nod-like receptor（NLR）family：a tale of similarities and differences［J］.PLoS One, 2008,3（4）：e2119.

［9］ Bonardi V, Dangl JL.How complex are intracellular immune receptor signaling complexes?［J］.Frontiers in Plant Science, 2012, 3：237.

［10］ Correa RG, Milutinovic S, Reed JC.Roles of NOD1（NLRC1）and NOD2（NLRC2）in innate immunity and inflammatory diseases［J］.Biosci Rep, 2012, 32：597-608.

［11］ Kaparakis M, Philpott DJ, Ferrero RL.Mammalian NLR proteins；discriminating foe from friend［J］.Immunology and Cell Biology,2007, 85：495-502.

［12］ Magalhaes JG, Philpott DJ, Nahori MA, et al.Murine Nod1 but not itshuman orthologuemediates innate immune detection of tracheal cytotoxin［J］.EMBO Rep, 2005, 6：1201-1207.

［13］ Meylan E, Tschopp J, Karin M.Intracellular pattern recognition receptors in thehost response［J］.Nature, 2006, 442：39-44.

［14］ Tattoli I, Travassos LH, Carneiro LA, et al.The nodosome：Nod1 and Nod2 control bacterial infections and inflammation［J］.Semin Immunopathol, 2007, 29（3）：289-301.

［15］ Correa RG, Milutinovic S, Reed JC.Roles of NOD1（NLRC1）and NOD2（NLRC2）in innate immunity and inflammatory diseases［J］.Biosci Rep, 2012, 32：597-608.

［16］ Seth RB, Sun L, Chen ZJ.Antiviral innate immunity pathways［J］.Cell Res, 2006, 16：141-147.

［17］ Watanabe T, Asano N, Fichtner-Feigl S, et al.NOD1 contributes tomousehost defense against Helicobacter pylori via induction of type I IFN and activation of the ISGF3 signaling pathway［J］.Clin Invest, 2010, 120：1645-1662.

［18］ Cooney R, Baker J, Brain O, et al.NOD2 stimulation induces autophagy in dendritic cells influencing bacterialhandling and antigen presentation［J］.Nat Med, 2010, 16：90-97.

［19］ Travassos LH, Carneiro LA, Ramjeet M, et al.NOD1 and NOD2direct autophagy by recruitingATG16L1 to the plasmamembrane at the site of bacterial entry［J］.Nat Immunol, 2010, 11：55-62.

［20］ Travassos LH, Carneiro LA, Girardin S, Philpott DJ.NOD proteins link bacterial sensing and autophagy［J］.Autophagy, 2010, 6：409-411.

［21］ Uehara A, Fujimoto Y, Fukase K, Takada H.Varioushuman epithelial cells express functional Toll-like receptors, NOD1 and NOD2 to produce anti-microbial peptides, but not proinflammatory cytokines［J］.Mol Immunol, 2007, 44（12）：3100-3111.

［22］ Kim YG, Park JH, Daignault S, et al.Cross-tolerization between NOD1 and NOD2 signaling results in reduced refractoriness to bacterial infection in NOD2-deficientmacrophages［J］.Immunol,2008, 181：4340-4346.

［23］ Rosenstiel P, Till A, Schreiber S.NOD-like receptors andhuman diseases［J］.Microbes and Infection, 2007,9（5）：648-657.

［24］ Schreiber S, Rosenstiel P, Albrecht M, et al.Genet-ics of Crohn disease, an archetypal inflammatory barrier disease［J］.Nat Rev Genet, 2005, 6：376-388.

［25］ Biswas A, Petnicki-Ocwieja T, Kobayashi KS.Nod2：a key regulator linkingmicrobiota to intestinalmucosal immunity［J］.Mol Med（Berl）, 2012, 90（1）：15-24.

［26］ 黄鸿眉.NOD1、NOD2：两个重要的天然免疫胞内识别受体［J］.国际免疫学杂志, 2006, 29（1）：23-26.

［27］ Podolsky DK.Inflammatory bowel disease［J］N Engl J Med,1991, 325：928-937.

［28］ Bonen DK, Ogura Y, Nicolae DL, et al.Crohn’s disease-associated NOD2 variants share a signalling defect in response to lipopolysaccharide and peptidoglycan［J］.Gastroenterol, 2003, 124：140-146.

［29］ Albrecht M, Domingues FS, Schreiber S, Lengauer T.Structural localization of disease-associated sequence variations in the NACHT and LRR domains of PYPAF1 and NOD2［J］.FEBS Lett, 2003, 554（3）：520-528.

［30］ Borzutzky A, Fried A, Chou J, et al.NOD2-associated diseases：Bridging innate immunity and autoinflammation［J］.Clin Immunol, 2010, 134（3）：251-261.

［31］ Okafuji I, Nishikomori R, Kanazawa N, et al.Role of the NOD2 genotype in the clinical phenotype of Blau syndrome and earlyonset sarcoidosis［J］.Rthritis Rheum, 2009, 60（1）：242-250.