李素贞 陈景堂

（河北农业大学农学院 国家玉米改良中心河北分中心，保定 071001）

锌和铁是生物体所必需的微量元素，在植物的生长发育过程中有着重要作用［1］。锌是生物体300多种酶和重要蛋白质的结构辅助因子［2］。锌不仅参与机体的各种代谢，在生物膜稳定和基因表达调控等生理机能中也担负着重要的角色［3］。适量增加植物体内锌的含量可提高作物产量，而锌的缺乏会导致叶绿素、脂质、蛋白、质膜的氧化破坏。植物体内锌离子的过度积累又会对植物产生毒害。

铁在细胞呼吸、光合作用和金属蛋白的催化反应过程中发挥重要作用，是重要的电子传递体。因此，铁元素在原核和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能。另外，细胞内过高的Fe3+/Fe2+氧化还原势会导致超氧化合物的产生，对细胞造成伤害［4］。因此，严格控制植物体内金属离子的平衡是至关重要的，这依赖于各种转运体的协同作用，包括锌、铁转运体蛋白家族（Zinc-regulated transporters，Ironregulated transporter-like proteins，ZIP）、自然抗性相关巨噬蛋白家族（The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP）、阳离子扩散辅助蛋白家族（Cation diffusion facilitator proteins，CDF）、植物重金属ATP酶家族P1B-ATPase（Heavy metal ATPases，HMA）、黄色条纹蛋白家族（yellow stripe-like，YSL）和三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）。这些运输蛋白对于植物锌铁吸收、体内分配以及维持细胞内锌铁离子的平衡具有重要作用［5，6］。

1 参与锌铁吸收的蛋白

参与锌铁吸收的蛋白主要有3类，都是以蛋白家族形式存在的.包括ZIP即锌调控转运体（Zincregulated transporter，ZRT）和铁调控转运体（Ironregulated transporter，IRT），黄色条纹蛋白家族家族（yellow stripe-like）和自然抗性相关巨噬蛋白家族（NRAMP）等蛋白定位于质膜上，其主要参与重金属离子从质外体或细胞器中转运至细胞质的过程［5］。

1.1 ZIP蛋白家族

ZIP即锌调控转运体（Zinc-regulated transporter，ZRT）和铁调控转运体（Iron-regulated transporter，IRT）。酵母功能互补试验显示ZIP家族基因能够转运包括Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+在内的多种金属离子［7］。ZIP一般由309-476个氨基酸残基组成，有8个潜在的跨膜结构域和相似的拓扑结构，第3和第4跨膜区之间有一长的可变区，可变区位于胞内，其C、N-末端位于胞外，该区富含组氨酸残基，可能与金属的结合、转运有关［7］。

目前在拟南芥、水稻、蒺藜苜蓿、大豆、野生型二粒小麦、葡萄等植物中鉴定出ZIP基因并对其功能进行了研究。在拟南芥中发现16个ZIP家族基因，AtIRT1是通过酵母互补试验分离得到的第一个ZIP功能基因，其主要在根部表达，且该基因的过表达可导致镍的过度积累［8-12］。AtIRT2主要在根部表达，定位在囊泡，推测具有细胞内过量金属元素的解毒功能［13，14］。AtIRT3能互补锌、铁转运双突变体，过表达AtIRT3会使锌在地上部、铁在地下部积累［15］。表达分析显示，AtZIP1、AtZIP5、AtZIP9、AtZIP12和AtIRT3受缺锌诱导，由此可推测，这些基因在缺锌条件下可能增强锌的吸收能力［16］。

ZIP家族基因在水稻中也有研究报道［17-22］，OsIRT1为铁转运体，在缺铁条件下负责从土壤中吸收铁［11］，其过表达可使地上部、地下部和成熟种子中的锌铁含量提高［22］。OsZIP1和OsZIP3受缺锌诱导于地上部和地下部中表达量升高，而OsZIP2主要在地下部表达升高［17］。原位杂交试验显示OsZIP1和OsZIP3主要在根和茎的维管束和根部韧皮部细胞中表达［17］，而OsZIP4则主要在韧皮部和分生组织表达［18］。过表达OsZIP5或OsZIP8会使水稻地上部的锌含量降低，而地下部中锌过量积累［20，21］。

野生二粒小麦中克隆的TdZIP1为缺锌诱导的锌转运体，其定位在内质网，过表达TdZIP1导致锌在细胞内的积累产生细胞毒性［23］。Northern分析发现GmZIP1在缺锌23 d的大豆根、茎和叶中不表达，但在缺锌大豆的根瘤中表达，且随着缺失天数增加至35 d时，表达量达到最高，推测GmZIP1可能在植株与根瘤菌的共生中发挥作用［24］。在模式豆科植物蒺藜苜蓿中MtZIP1、MtZIP5和MtZIP6互补锌缺陷酵母突变株，MtZIP4和MtZIP7互补锰缺陷酵母突变株，而MtZIP3、MtZIP5和MtZIP6互补铁缺陷酵母突变株［25］，说明ZIP家族基因具有一定的金属元素选择性。ZmZLP1是从玉米花粉cDNA文库中分离得到的ZIP-like家族基因，其编码蛋白定位在内质网中，可能负责锌从内质网到细胞质的转运，参与未折叠蛋白反应，并且提高酵母细胞的耐热性［26］。

1.2 YSL蛋白家族

ZmYSL1是最早从缺铁胁迫玉米根系cDNA文库中分离得到的基因，它是多肽转运蛋白家族的一个成员，能够转运麦根酸类物质［Muginetic acids，Mas与铁离子螯合物（Mas-Fe3+）的功能］，其酵母互补试验也证明了YSL1的铁转运载体功能［27，28］。从玉米中共预测出15个YSL基因，跨膜结构域6-17个，编码序列891-2 088 bp。另有研究表明ZmYSL1定位在侧根和根冠的表皮细胞及叶肉细胞，主要参与铁及其他多种金属离子的吸收与胞内运输［29］。玉米YSL1突变体由于不能转运Fe3+-植物载体复合物（PS）而使玉米叶脉间失绿，呈现黄色条纹状，因此被命名为yellow stripe（YS）［30］。水稻基因组中具有15个YSL成员，在缺铁条件下OsYSL2在叶片中的表达量升高，且证明OsYSL2可转运尼克烟酰胺（NA）-Fe和NA-Mn螯合物。这些结果表明，OsYSL2负责NA-Fe和NA-Mn在韧皮部的运输，并且具有将铁和锰转运至籽粒中的作用［31］。OsYSL16则在维管束MA-Fe3+的分配中起重要作用［32］。

AtYSL1、AtYSL2和AtYSL3是拟南芥中的YSL家族成员。AtYSL1基因特异存在于幼芽和花粉中，高铁条件下，AtYSL1在幼芽中的转录水平会增高。ysl1突变体地上部积累大量NA，而种子中的铁和NA含量明显比野生型的含量低［33］。这些结果表明，AtYSL1可能具有将铁从茎和叶转移至种子中的作用［33］。此外，AtYSL2转运NA-Fe和NA-Cu螯合物，在根部和地上部都有表达，并且AtYSL2的转录水平受铁和铜的调节，表明AtYSL2可能参与金属离子在维管束中的横向运输［5，34］。AtYSL3可能在维管束细胞中起到转运金属-NA复合物的作用［35］。HvYSL5主要在大麦的根中表达（成熟根区表达，根尖不表达），并且受缺铁诱导，时空表达分析发现HvYSL5呈现出昼夜节律，基因敲除后植物没有表现出明显的表型，推测HvYSL5可能具有瞬时储存铁或者植物铁载体的功能［36］。

1.3 NRAMP蛋白家族

自然抗性巨噬蛋白（NRAMP）主要参与多种二价金属阳离子的转运，如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+等［37］。NRAMP家族基因编码多肽分子，其氨基酸序列具有高度的同源性和相似的二级结构，包括10-12个跨膜结构域，1-2个糖基化的胞质外环状结构和一个胞质内的转运蛋白结构域［5，38］。

在拟南芥中和水稻中分别克隆了5个AtNRAMP基因和3个OsNRAMP基因，AtNRAMP1、3、4与水稻OsNRAMP1和OsNRAMP3属于一类。AtNRAMP2-5和水稻OsNRAMP2代表另一类蛋白［39］。AtNRAMP1、2在根和芽中表达，过表达AtNRAMP1的番茄对铁胁迫的耐受力增强［40］。另有研究表明，AtNRAMP3和AtNRAMP4定位到液泡膜上，负责将Fe2+从液泡运到胞质，其转录水平受到细胞内铁离子浓度的调节。低铁条件下，nramp3和nramp4导致种子萌发晚于野生型，AtNRAMP1、3、4能互补酵母缺陷型双突变株对锰或铁的吸收功能。AtNRAMP3和AtNRAMP4能够提高酵母对镉的敏感性，并导致镉的积累。该结果表明AtNRAMP编码多种底物特异性的金属转运蛋白［41，42］。在水稻中，微阵列分析发现OsNRAMP1在缺铁条件下表达上调，OsNRAMP1蛋白定位在质膜上，可转运Fe和Cd，主要在根中表达，参与细胞中镉的吸收与积累［43］。OsNRAMP2主要在叶中表达，OsNRAMP3在所有组织都表达。Sperotto等［44］发现，OsNRAMP7和OsNRAMP8与水稻籽粒中锌、铁的浓度呈现出负相关性。说明这两个基因对籽粒中锌、铁离子浓度的积累不利。

2 参与锌铁排出的蛋白

参与锌铁排出的蛋白主要有3类，包括阳离子扩散协助家族蛋白（CDF）、P1B型ATPases、三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）具有将重金属运载出细胞质或进入特定的细胞器的功能，因此可能具有解毒功能［5，6］。

2.1 CDF蛋白家族

CDF（cation diffusion facilitator）蛋白可将胞质内过量的Zn2+转运至胞外，或区室化胞内过量的Zn2+，以起到解毒或储存的作用［45］。大部分的CDF家族成员具有6个跨膜结构域，并有相似的拓扑结构。CDF家族最保守的序列为第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ跨膜区，具有极保守的极性或带电氨基酸，可能与底物的转运有关［46］。在植物中第一个鉴定出的CDF家族成员是ZAT，后被更名为AtMTP1，其编码蛋白定位在叶片和根部细胞的液泡膜上，可能具有将Zn2+运载至液泡的作用［47］。过表达AtMTP1可提高植物对高锌胁迫的耐受性，并且会提高植株根部锌含量［48］。AtMTP3定位在液泡膜上，在zrc1cot1双突变的芽殖酵母中能够提高对锌和钴的耐受性，过表达AtMTP3可增加拟南芥根和莲座叶中锌的含量和提高耐受性。野生型拟南芥在高锌、高钴浓度且无毒害条件下，能使AtMTP3在根毛区的表皮细胞中表达增强。RNA干扰AtMTP3会导致植物细胞对高锌胁迫比较敏感［49］。HvMTP1是大麦中的一个CDF成员，与AtMTP1高度相似，但不像AtMTP1高度选择Zn2+，而是对Zn2+和Co2+高度亲和，其定位在液泡膜上［50］。

水稻中也有CDF家族蛋白的研究，OsMTP1是一个二价阳离子转运蛋白，其定位在细胞膜上，可转移Zn2+和Cd2+以及其他重金属离子，并且保持金属离子的体内平衡［51］。OZT1是在水稻中发现的一个定位到液泡中的CDF家族蛋白，其在各种组织中均有表达，并且在高Zn2+和Cd2+胁迫条件下表达上调，OZT1在酵母中表达能够增强酵母对Zn2+和Cd2+的耐受性，这些试验表明，OZT1能够转运和保持植物体中Zn、Cd和其他重金属的平衡［52］。

2.2 P1B型ATPases

P型ATPases超级家族包括多个重金属ATPases（HMA），P1B型ATPases是其中的一个亚族。Zn2+、Cd2+、Pb2+和Co2+等离子利用水解ATP释放的能量进行跨膜运输。P-ATPase的合成包括一个磷酸化介导的酶促反应，故称之为P-ATPases［53］。ATPase一般含8个跨膜结构域，在第Ⅵ与第Ⅶ跨膜结构域之间有一个大的胞质环，环上有磷酸化结构域。膜内有Cys-pro-Cys/His/Ser基序，在金属元素转运过程中起作用［1，54-56］。

在拟南芥中发现了8个HMA成员，其中HMA1-4是二价阳离子载体，参与Cd2+/Pb2+/Zn2+/Co2+的运输，HMA5-8是单价阳离子载体，参与Ag+/Cu+的运输［53，57］。拟南芥中AtHMA2和AtHMA4是Zn2+和Cd2+的高亲和性质膜转运蛋白定位在质膜上，主要在根、茎和叶片的微管组织表达，通过向胞外排出过量的Zn2+和Cd2+，提高植物对Zn和Cd的耐受性［58］。hma2和hma4双突变体导致地上部锌的含量降低，hma4单突变使锌的含量也比野生型低，HMA2是依赖于Zn2+的ATPase，虽然也能被Cd2+等离子所激活，但激活程度比Zn2+低，过表达AtHMA4能够改善根在高浓度Zn2+和Cd2+条件下的生长状况，并且地上部锌和镉的含量增加。这些结果表明，HMA2和HMA4对于调节植物体内锌离子的平衡有重要作用，HMA4可能参与金属离子咋木质部的装载［59-62］。在烟草中表达AtHMA4可以改变Zn和Cd在根和地上部的分配，并且增加植株对Zn和Cd的耐受性［63］。

2.3 三磷酸结合盒转运蛋白

三磷酸结合盒转运蛋白包含4-6个跨膜疏水区域、ATP结合区域和核苷酸结合区域。三磷酸结合盒转运蛋白利用水解ATP释放的能量使多种重金属离子进行跨膜运输。MRP与PDR是目前了解得最为详细的三磷酸结合盒转运蛋白亚族，与重金属的解毒有关。参与锌铁转运的三磷酸结合盒蛋白，目前在水稻中有OsPDR9，锌和镉可诱导OsPDR9在水稻幼苗的根中表达［63］在拟南芥中发现了120个三磷酸结合盒转运蛋白，但目前研究得还很少。

3 结语

增加粮食作物籽粒中的锌铁含量，对满足人类锌铁营养具有重要意义，研究作物籽粒富集锌和铁的生理机制，利用现代分子生物技术生物强化籽粒中锌铁的含量是增加籽粒中锌铁含量的一种途径。目前，已知许多转运蛋白参与了植物体内锌铁离子平衡网络系统，一些蛋白也被应用到植物的转基因研究中，如在大麦中过表达AtZIP1基因能够增加锌和铁在种子中的含量。同样，过表达OsIRT1基因，水稻中锌和铁的含量在地上部、地下部和种子中都有所提高。但在水稻中过表达OsZIP4、OsZIP5、OsZIP8和OsZIP9，结果导致过量的锌聚集于根部，降低了植株地上部分的锌含量，没有达到在籽粒中增加锌含量的目的。因此，这些基因的过表达对水稻籽粒中锌的富集不利。这些结果表明，异位过表达对于锌铁的积累与分布可能会起到一定的作用。然而，有关锌铁转运蛋白在籽粒中的研究还很少。所以，可以先研究籽粒中某些基因的表达模式，鉴定出其中对于转运或储藏锌铁起关键作用的基因，然后进行过表达或者组织特异性表达这些基因，以提高籽粒中锌铁含量的目的。

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