马天翔，肖建华

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种高发传染病，宿主范围包括大部分食肉目动物[1]。CDV可以感染不同器官和组织的上皮细胞、间质细胞、神经内分泌细胞，与造血中枢神经系统的持续感染有关。常规免疫接种在正常情况下是一种高度有效的预干细胞，引发全身型或神经型的临床过程，并在中枢神经系统和淋巴组织中形成持续感染，免疫抑制和脱髓鞘性脑脊髓炎是代表性的病症。据报道，犬瘟热在法国、德国、美国、日本和芬兰等常规免疫执行很好的国家仍然会发生流行，表明预防接种过的犬也可能发病，而其发病机制亦可能存在新的变化[2-4]。犬瘟热作为犬的重要传染病，可表现为多种复杂症状，由于其典型的双相热型在近期的临床病例中并不常见，致使临床确诊较为困难。因此，实验室诊断CDV是非常必要的。

1 犬瘟热的诊断

1.1 病毒的分离与鉴定

CDV分离培养是确诊该病的最根本方法，但工作量较大，且CDV对外界环境的抵抗力很弱，其脂质囊膜结构较脆弱，易被光和热灭活，致使病毒分离成功率较低。分离CDV用的组织细胞有原代细胞及传代细胞系两大类。原代培养细胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、肾细胞等[5]。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺脏巨噬细胞进行培养。分离CDV的传代细胞系有犬肾细胞系（MDCK）、狗肾细胞系（DK）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）等多种细胞系。 用Vero 细胞分离培养CDV被认为是首选细胞。近年来用来源于犬恶性组织细胞增多症的组织细胞建立的细胞系CCT 细胞培养CDV获得了成功[6]。

分离后的病毒通常可以结合电镜检查、动物回归试验以及病毒特异性抗原和特异性核酸诊断试验等方法对病毒进行进一步的鉴定。在进行动物回归试验时，各种接种途径均可使雪貂、犬和水貂发生具有临床症状的感染，电镜观察是检查、确定CDV感染最简便快速的方法。遇秀玲等报道，采用电镜技术对CDV93039 株和CDVMD—77 株在体外培养细胞中的增殖过程和所致病变特点进行了观察，发现CDV93039 株少见长丝状核衣壳聚集及典型的胞膜上出芽病毒粒子，包涵体以电子致密小体为主：CDVMD—77 株可见成堆存在的核衣壳结构，胞膜上出芽增殖明显可见，包涵体以核衣壳结构聚集为主，后期也有电子致密小体[7]。房红莹等对临床诊断为犬瘟热的14 例病犬，取脑组织，运用细胞培养、合胞体检查、包涵体检查、免疫荧光试验、电镜观察5种检测方法，就犬瘟热的微生物学诊断进行了系统的研究，结果表明，建立的改良离子捕获电镜法用于检测犬脑匀浆和犬脑接种细胞培养物，与离子捕获电镜法、免疫电镜法及直接电镜法相比效果更为理想[8]。但采用电镜对病毒进行鉴定时只能观察病毒的形态结构，很难与同科的病毒相区别。传统的病毒分离鉴定技术的结果准确、可靠，但分离过程繁琐、时间长，并且在病后期由于中和抗体的出现很难分离到病毒。

1.2 免疫学检测方法

1.2.1 荧光抗体技术

杨百亮等建立了用于检测犬瘟热病毒的间接荧光抗体染色法，试验确定了1∶80 稀释的抗犬瘟热单克隆抗体和32倍稀释的荧光素标记羊抗鼠IgG为适宜的工作浓度，对自然感染犬的眼分泌物、鼻汁、粪便和血涂片CDV检出率分别为21%、14%、15%和76%，说明荧光抗体技术是一种简便、快速、特异的检测犬瘟热的方法[9]。岳妙姝将犬瘟热病毒纯化后免疫雌性BALB/c 小鼠，取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合，经克隆和间接ELISA筛选，获得6株稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用G蛋白亲和层析柱对腹水进行纯化，将纯化后的单抗腹水用异硫氰酸荧光素（FITC）标记制备荧光抗体，并对该荧光抗体进行鉴定，吸收试验、阻断试验和与犬细小病毒（CPV）、轮状病毒（RV）及犬腺病毒（CAV）的交叉试验表明，所制备的荧光抗体具有特异性强、敏感性高的特点；应用该技术制备的单克隆抗体对感染CDV的细胞进行了检测，结果表明，该单克隆抗体显示了对CDV的高特异性，用该抗体制备的荧光抗体在对CDV的实验室诊断中具有快速和特异性高的特点[10]。

1.2.2 酶联免疫吸附法

李娜建立了间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）的诊断方法以检测CDV血清抗体水平，通过测定CDV抗原包被的最佳浓度、血清的最佳稀释度、酶标HRP 二抗的最适工作浓度等优化试验，选择间接ELISA最佳的反应条件，试验结果表明，抗原的最佳包被浓度为0.525 μg·100 μL-1，最适血清稀释度为1∶40，酶标HRP 二抗的最适工作浓度为 1∶2000[11]。

1.2.3 琼脂扩散试验

任文陟等用CD 鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫绵羊制备琼脂扩散抗体，建立了琼脂扩散试验方法[12]。虽然只能粗略地对抗体进行测定，灵敏性较差，但不需要特殊仪器，操作简单，适宜在基层临床中推广。

1.2.4 胶体金试纸条法

胶体金试纸条法是基于单克隆抗体建立的诊断技术。An 等利用获得的2 株单克隆抗体建立了胶体金试纸条诊断技术，并用巢式PCR 进行比较，虽然敏感性（89.7%和85.7%）和特异性（94.6%和100%）略低，但其使用方便，造价低廉，所以更容易在临床上推广[13]。

1.3 分子生物学技术

反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断法比传统诊断法具有更高的敏感性和特异性，尤其在犬瘟热发病早期，机体尚未产生免疫应答时，RTPCR诊断法便能够作出早期诊断，有利于及早地确诊经济动物（貂、狐狸和貉子）及野生保护动物（狮、虎和豹）等是否感染了犬瘟热病毒，以便采取有效的防治措施，这对降低经济损失、保护生态平衡具有重要意义[14]。鞠会艳等针对犬瘟热病毒N和H蛋白的核苷酸序列分别设计引物，利用RT-PCR技术检测了来自不同地区的水貂、狐狸、貉子和老虎病料中犬瘟热病毒的感染情况，研究结果表明，应用RT-PCR技术对病料中犬瘟热病毒的检测具有科学性和可信度[15]。Stanton 等对半巢式PCR 方法和免疫荧光法、病理组织学方法及免疫组化法进行比较，发现半巢式PCR 方法更适于发病后的检测，能够在区别疫苗株和流行株[16]。

1.4 包涵体检查

包涵体主要存在于膀胱、胆管、胆囊和肾盂上皮细胞内，大多存在于胞浆内，一般呈现圆形或椭圆形。但CDV形成的包涵体难以与狂犬病病毒等所形成的包涵体及类似物区分，因此确诊犬瘟热需要与其他方法相结合。

2 犬瘟热的预防

2.1 定期接种疫苗

幼犬首免在45～50日龄进行，每隔21～28 d 加强免疫1次，连续免疫3次（如犬首免时间在3月龄以上，可按上述程序连续免疫2 次），以后每年加强免疫1次。疫苗目前主要用进口的犬二联苗、五联苗、六联苗或七联苗。免疫时同时注射免疫增强剂（胸腺肽等），免疫效果会更好。如犬场曾发生过犬瘟热、细小病毒病等疫情，建议在幼犬出生后28日龄免疫1次犬小二联苗（犬瘟热和细小病毒二联疫苗）。

2.2 加强饲养管理

每周1 次对犬舍以3%烧碱溶液或10%福尔马林消毒。定时定量饲喂，并给予充足的饮水，圈舍要通风干燥，同时每天进行适量的户外运动，增强机体抵抗力。发现病犬或疑似病犬应及时隔离、治疗，预防继发感染，对无治疗价值的进行扑杀或实施安乐死，实行无害化处理。各养殖场尽量做到自繁自养，防止外来疫源传入。

3 小 结

荧光抗体技术、ELISA、胶体金试纸条法与传统的病毒分离培养相比，具有敏感、特异、准确等优点。近年来，随着分子生物学的发展，国内外相继建立起CDV核酸杂交和RT-PCR 检测法，其方法比免疫学检测法具有更高的敏感性和特异性，尤其在CDV感染早期，尚未产生免疫应答的情况下RT-PCR 检测法便能够作出早期诊断。但犬瘟热的预防也不容忽视，只有定期接种疫苗、加强饲养管理，才能控制犬瘟热的发生。

[1]Deem S L,Spelman L H,Yates R A,et al.Canine distemper in terrestrial carnivores:a review[J].Zoo Wild Med,2000,31:441-451.

[2]Lan N T,Yamaguchi R,Kien T T,et al.First isolation and characterization of canine distemper virus in vietnam with the immunohistochemical examination of the dog[J].Vet Med Sci,2009,71（2）:155-162.

[3]Takayama I,Kubo M,Takenaka A,et al.Pathological and phylogenetic features of prevalent canine distemper viruses in wild masked palm civets in Japan[J].Comp Immunol,Microbiol and Infec Dis,2009（32）:539-549.

[4]Simon-Martnez J,Ulloa-Arvizu R,Soriano V E,et al.Identification of a genetic variant of canine distemper virus from clinical cases in two vaccinated dogs in Mexico[J].Vet,2007（175）:423-426.

[5]高大潮.犬瘟热病的诊治[J].现代农业科技,2009（9）:255.

[6]Yamaguchi R,Kojimoto A,Sakai H,et al.Growth characteristics of canine distemper virus in a new cell line CCT cells originated from canine malignant histiocytosis[J].J Vet Med Sci,2005,67（2）:203-206.

[7]遇秀玲,田克恭,杨怡,等.犬瘟热病毒（CDV）93039与CDVMD-77 株感染Vero 细胞的电镜观察[J].中国兽医学报,2000,20（1）:22-25.

[8]房红莹,陆承平,马勋,等.犬瘟热的微生物学诊断研究[J].中国兽医学报,1997,17（2）:148-151.

[9]杨百亮,张娟娟,段县平,等.荧光抗体技术诊断犬瘟热的研究[J].中国动物检疫,2004,21（5）:23-25.

[10]岳妙姝.犬瘟热病毒荧光抗体的建立及初步应用[D].长春:长春理工大学,2008.

[11]李娜.犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆与表达及间接ELISA 检测方法的初步建立[D].扬州:扬州大学,2007.

[12]任文陟,陈秀芬,母连志,等.犬瘟热琼脂扩散试验方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报,1994,14（4）:398-401.

[13]An D J,Kim T Y,Song D S,et al.An immunochromatography assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspected to have canine distemper[J].J Virol Methods,2008,147（2）:244-249.

[14]王兰萍,李厚达.犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用[J].实验动物科学与管理,2002,19（1）:4-6.

[15]鞠会艳,夏咸柱,高玉伟,等.用RT-PCR 检测病料中犬瘟热病毒的研究[J].吉林农业大学学报,2006,28（3）:317-320.

[16]Stanton J B,Poet S,Frasca S Jr,et al.Development of a seminested reverse transcription polymerase chain reaction assay for the retrospective diagnosis of canine distemper virus infection[J].J Vet Diagn Invest,2002,14（1）:47-52.