于佳动，蔡静平，王钦宏

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.中国科学院天津工业生物技术研究所系统微生物工程重点实验室，天津 300308）

0 引言

酵母单糖转运蛋白是一类位于细胞质膜的重要跨膜蛋白，负责将胞外的糖类转运至胞内供细胞代谢利用，在促进单糖的吸收、代谢方面具有重要的生物学功能[1].近年来，人们在研究以酵母菌作为转化木质纤维素水解液的菌种生产燃料乙醇等高附加值生物基产品过程中，发现单糖转运蛋白可显著提高木质纤维素水解液转化乙醇的速率，改善生物转化利用度，因而对该蛋白的深入研究被广泛关注，成为目前该类糖转化利用的关键问题[2].

糖的代谢是从胞外转运至胞内开始的，对于细胞糖转运的研究主要集中在己糖转运的生理生化性质方面，而在糖由胞外进入胞内的转运如何影响糖的代谢利用研究相对较少.研究表明糖转运能力的差异可改变酵母菌的生长和代谢速率，进而限制了代谢终端产物浓度的提高，因此，糖转运是糖代谢利用的限速步骤之一[3].随着研究手段的进步，尤其是微生物基因组学及分子生物学技术的发展，一些具有天然利用五碳糖能力的酵母陆续完成基因组解析[4]，使得研究酵母单糖转运蛋白从酿酒酵母逐渐扩展到其他多种酵母，特别是一些能够利用天然木糖的酵母更是成为研究的重点.

1 酵母菌单糖转运蛋白的研究方法和分类系统

从基因组出发探究酵母单糖转运蛋白序列信息是最直接、最有效率的研究手段.通过对不同酵母cDNA文库序列及基因组信息的收集，与已知菌种的单糖转运蛋白序列比对，可以挖掘出新菌种可能具有单糖转运蛋白性质的序列，再通过功能互补实验即可能揭示新菌种单糖转运蛋白的性质.例如，研究和应用较多的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[5]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[6]和树干毕赤酵母(Pichia stipitis)等菌种在利用己糖和五碳糖上显示出不同的特性，人们对它们的糖转运蛋白均有较充分的研究.研究者通常以这些已知菌种为依据，利用GenBank上公布的各种酵母菌的基因组序列，挖掘对不同单糖底物转运偏好性高的单糖转运蛋白.进一步将这些新发现的酵母单糖转运蛋白进行基因、蛋白质序列的比对、系统进化树的分析，即可将它们归属于协助转运扩散超家族（Major facilitator superfamily,MFS）[7]，从而不断丰富酵母单糖转运蛋白比对源.

酵母中负责糖转运的蛋白种类繁多.研究者已经发现，在酿酒酵母6 000多个基因中，编码糖转运蛋白的基因有35个，其他酵母菌也具有相同的特性.为了方便对已知糖转运蛋白的查找和研究、利用，国外研究者建立了一个专门收录转运蛋白序列信息的数据库——转运蛋白分类系统（The Transporter Classification，TC）[8]，该系统将不同来源的糖转运蛋白以序列同源性、宿主和功能为依据进行了分类，共分为两大超家族，除酵母糖转运蛋白属于MFS超家族外，另一类为腺苷三磷酸结合盒转运蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC transporter superfamily），细菌糖转运蛋白一般属于此类超家族[9].

在TC转运蛋白分类系统中，MFS超家族又被分为17个不同的家族，最大的是糖转运蛋白家族（Sugar Porter Family）编号为TC#2.A.1.1.与工业发酵、酿酒工业、木质纤维素水解液利用相关的酿酒酵母己糖转运蛋白家族（HXT）、粟酒裂殖酵母高特异性葡萄糖转运蛋白家族（Ght）、树干毕赤酵母糖转运蛋白家族(SUT1-3)等均收录其中.

另有一个专门针对酵母糖转运蛋白的数据库——酵母转运蛋白数据库（Yeast Transporter Protein Database）,可以对酵母单糖转运蛋白进行功能注释结果进行分类或预测其功能.根据转运蛋白数据库收录的信息，以同源性为依据去寻找其他酵母中新的单糖转运蛋白序列，不断发现新的高效单糖转运蛋白.

2 酵母菌单糖转运蛋白的结构分析

蛋白质的空间构象决定蛋白质的功能.具有相同空间结构的蛋白质在氨基酸组成、功能方面均具有一定的共性.对酵母单糖转运蛋白保守性分析也印证了上述观点[10-11].对酵母单糖转运蛋白空间结构的分析有助于了解其转运单糖的生物学功能，同时，通过分析结构，联系功能信息也可为转运机理的揭示和结构功能的改造奠定基础.

人们在研究转运蛋白时发现，酵母单糖转运蛋白通常由400～600个氨基酸残基组成，N端和C端都在细胞质的一侧.MFS超家族糖转运蛋白的二级结构一般是由12个跨膜疏水α螺旋组成的，在有些酵母中也发现含有6个、14个或24个的疏水跨膜螺旋[12].含14个跨膜螺旋的转运蛋白是由两个位于胞内中间的环状结构α螺旋插入到细胞膜中形成的，而含有24个疏水跨膜螺旋结构可能是由于早期进化过程中形成了二聚体.但是，进一步的研究发现，这些转运蛋白在螺旋数量上的差异并不影响糖转运蛋白的功能[13].

由于MFS超家族蛋白属于膜蛋白，在与膜分离纯化过程中存在一定难度，三级结构解析方面的研究还很少，第一个高分辨率的三级结构直到2003年才被纯化出来，是由Abramson等[14]解析出负责乳糖转运的乳糖透过酶（LacY）蛋白的三级结构.2012年，清华大学的颜宁研究小组通过对大肠杆菌中负责转运木糖的XylE转运蛋白晶体结构的分析，也呈现出典型的MFS超家族折叠方式[15].MFS超家族的12个跨膜α螺旋分成两个亚基，呈现出一种向细胞外侧开放接收糖类、部分封闭的构象.基于MFS超家族在结构和功能上表现出的共性，根据氨基酸序列模拟酵母单糖转运蛋白的结构，均表现出MFS超家族的特征[16].但是，迄今为止还未见有高分辨率酵母单糖转运蛋白晶体的报道.

3 酵母菌单糖转运蛋白的转运机制及表达调控

酵母菌单糖转运蛋白转运过程及其机制是人们一直非常关注的重点之一，目前已经从分子水平揭示了糖从被转运蛋白识别、结合、至释放的整个动态过程.在转运蛋白MFS超家族中，酵母单糖转运蛋白依靠两种方式进行转运，一种是依靠胞内外浓度梯度进行促进扩散（Facilitated diffusion），另一类则是依靠质子动力的H+协同转运蛋白（H+Symporter transporter） 或 Na+协同转运蛋白 （Na+Symporter transporter）[17]来实现转运过程.

那七八个男人每人一棍，有揍他背的，有揍他胸的，有揍他腰的，有揍他腿……癞阿小一下挨了七八棍，就像一条死狗那样赖在地上，哭啊喊啊叫啊……当然不忘向他们求饶，最后轮到白天明，他接过木棍，对癞阿小说：“我去年就想揍你了，你个畜生贼性不改，今年我可得让你长点记性了。”白天明奋力一棍下去，嚓！只听得癞阿小一声惨叫，他的右腿断了。

酵母菌单糖转运首先涉及底物识别和释放的过程，Jardetzk等[18]提出了“交替通路”的机制，认为在糖转运过程中，单糖转运蛋白构象发生改变，整个过程不涉及到底物位点的变化，只涉及蛋白构象的变化，使底物结合位点交替开口于膜内外两侧，交替变化，最终完成糖的转运.Smirnova等[19]通过对单糖转运蛋白基因lacY的研究，提出了摇杆理论，该理论也与底物结合后引起转运蛋白构象变化有关，认为转运蛋白以底物结合部位为轴进行转动，将糖类转运至胞内，转运蛋白的开口方向也发生了变化，由最初的向外开口变成向内开口，这种理论后来又得到Kaback实验室通过双电子共振实验[20]、氨基酸荧光实验[21]、定向烷化实验[22]等生化实验证明.

糖转运蛋白的构象改变也与自身氨基酸残基参与质子的结合、传递、释放的过程有关.Kilian、Gardonyi等[23-24]在对可以转运木糖的间型假丝酵母和树干毕赤酵母中发现了Na+或H+结合的单糖:质子同向转运蛋白，因细胞具有保K+排Na+性质，细胞膜外Na+的浓度较高，即Na+的电化学梯度流向膜内，葡萄糖依靠Na+梯度所提供的能量，通过糖转运蛋白，与Na+一起转运至胞内，葡萄糖运输的速度与胞外Na+浓度成正比，随后Na+经细胞膜上回路又泵回胞外，H+由于呼吸作用产生的电子传递形成膜内外的质子梯度产生流向胞内的力参与葡萄糖的协同转运.

研究者也从分子遗传学的角度研究酵母单糖转运蛋白的作用机制，他们通过分析编码转运蛋白基因在整个糖代谢过程中扮演的角色，揭示其调控的功能，阐明转运蛋白的作用机制.例如，酿酒酵母体内含有18个己糖转运蛋白（HXT1～HXT17、Gal2） 和两个葡萄糖传感蛋白（Rgt1p、Snf2p）[25]，用敲除掉hxt1-hxt7基因的酿酒酵母菌进 行 功 能 互 补 实 验 证 明 HXT1～HXT4、HXT6、HXT7、Gal2为酿酒酵母体内主要负责转运葡萄糖的转运蛋白[3,26]，用敲除掉 hxt1～hxt17、gal2基因的酿酒酵母对 HXT8～HXT11、HXT13～HXT17 的功能验证，利用葡萄糖生长并不明显，hxt12基因被插入序列阻断，因此失去了转运糖的功能.部分己糖转运蛋白在酿酒酵母染色体中的位置也已确定，hxt1、hxt4、hxt5的位置是在染色体Ⅲ上[27].HXT6、HXT7蛋白序列仅有两个氨基酸的差异，它们的基因串联在一起，与hxt3基因的3′末端相邻，位于染色体Ⅵ上[28].

酵母菌单糖转运蛋白受基质中葡萄糖浓度的调控，Johnston等[28]根据hxt1～hxt4基因在不同葡萄糖浓度下表达量的不同，揭示了它们在基质中不存在葡萄糖、低浓度葡萄糖和高浓度葡萄糖情况下单糖转运蛋白的诱导表达机制.发现有许多蛋白质，如葡萄糖阻遏因子Rgt1、Mig1，葡萄糖诱导因子Snf1、Grr1等参与了hxt1～hxt4基因的转录调控.Rgt1是一种结合在hxt1～hxt4基因前启动子区的阻遏物，当基质中不存在葡萄糖时，Rgt1抑制hxt1～hxt4基因的表达.hxt3基因的转录与葡萄糖的浓度无关，只通过Rgt1的活性来进行调节.hxt2、hxt4基因的转录在无葡萄糖的情况下也受到Rgt1的阻遏，在高浓度葡萄糖中受到另一种阻遏物Mig1的阻遏，只有在低浓度的葡萄糖中，hxt2、hxt4基因才能最大限度的表达.HXT1在高浓度条件下才能表达，Rgt1在高浓度葡萄糖条件下阻遏HXT1启动子的转录，必须启动另一条信号通路才能启动HXT1的表达，Reg1活化Act，启动HXT1启动子的转录.

RenVerwace[29]在对酵母菌hxt5基因的研究中发现，HXT5的表达不依赖葡萄糖浓度，而是由细胞生长的速度决定，当细胞低速生长时，hxt5基因的转录量增大，在细胞延迟期、稳定期主要负责糖的转运.此外，氧气也是调控单糖转运蛋白的重要因子[30-31]，树干毕赤酵母sut1～sut3基因的表达受氧的调控，在通氧情况下，才可以表达.因此，不同酵母单糖转运蛋白的转运分子机制是不同的，既由基质中葡萄糖浓度决定，也受氧浓度的调控来启动不同单糖转运蛋白转录、表达.

4 酵母菌单糖转运蛋白的分子改造与应用

在发酵条件下，细胞面临的环境不是一成不变的，要根据发酵具体要求选用稳定、高效且适应不同单糖底物的转运蛋白.因此，需要从实际应用的角度对单糖转运蛋白进行筛选、评价和改造.除利用葡萄糖发酵外，还有在酿酒工业中应用的果糖发酵，在食品添加剂生产中的应用木糖发酵等.目前在国内外最受关注的是木质纤维素水解液的发酵，因为木质纤维素的主要成分为纤维素和半纤维素，水解液中含有不同的单糖成分，包括葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和少量阿拉伯糖，由于基质由混合的不同种类单糖组成，要提高糖的综合利用率，对转运蛋白的调控提出了更高的要求.

现有的研究和应用证明，树干毕赤酵母、间型假丝酵母、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)等可以利用木质纤维素水解液进行发酵[2,32].树干毕赤酵母是目前公认发酵木糖最好的菌株之一，其单糖转运蛋白基因sut1～sut3已被克隆出来，SUT1～SUT3在2%木糖浓度环境下转运木糖的Km值约为20 mmol/L[31].从间型假丝酵母中克隆出的gxf1和gxs1是近年来人们研究最多的可以转运木糖的转运蛋白基因，已经被应用到酵母工程菌的构建，证明可以有效提高木糖的转化效率[33].在研究Candida succiphila和Kluyveromyces marxianus两个菌种提高木糖发酵效率的试验中，Stambuk等[34]发现两个低亲和性的木糖转运蛋白.在制作面包中经常使用的得巴利汉逊酵母（Debaryomyces hansenii）单糖转运蛋白XylHP也被证明具有木糖转运的能力[35]，但在酵母菌中，目前还没有发现可特异转运木糖的转运蛋白.

在酵母对木糖的转运环节中，目前的研究主要集中在对可利用木糖发酵酵母单糖转运蛋白功能的评价.Hamacher等[36]在酿酒酵母己糖转运蛋白功能互补试验中，发现 HXT4、HXT5、HXT7、Gal2 均可转运2%的木糖.本实验室的一株麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa Xu316）可以高效利用木糖发酵生产木糖醇，转化率达到0.85g/g，是木质纤维素水解液利用及混合糖发酵中应用价值较高的菌种.对其基因组基因进行预测、注释分析发现了23个假定的糖转运蛋白中，通过功能互补实验已验证出5个单糖转运蛋白分别在2%葡萄糖、木糖浓度下发挥糖转运功能（结果待发表）.

酵母单糖转运蛋白不仅表现出对葡萄糖、木糖的亲和性，果糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖也可作为不同单糖转运蛋白的底物.酿酒酵母己糖转运蛋白HXT1～HXT7可以转运果糖及甘露糖.Cason等在对S.pastorianus和S.bayanus发现了高亲和性果糖转运蛋白[37].树干毕赤酵母SUT1、SUT3可转运果糖，SUT3也可以转运半乳糖[31].Young等[38]对26种不同酵母来源的单糖转运蛋白进行了6种底物（葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、果糖、核糖）转运能力的测试，有10种转运蛋白至少可以利用一种单糖，通过序列比对，鉴定出树干毕赤酵母菌xut基因、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)和得巴利汉逊酵母菌的转运蛋白ORF.对阿拉伯糖的转运研究中，酿酒酵母可转运半乳糖的转运蛋白Gal2证明也可以转运阿拉伯糖[39-40]，在树干毕赤酵母中，新发现了可以转运阿拉伯糖的转运蛋白AraT，与酿酒酵母菌己糖转运蛋白Gal2相比，在阿拉伯糖（2%）消耗速率和菌体比生长速率上均比Gal2要低，但在低浓度阿拉伯糖（0.5%）情况下，AraT的转运效率要比Gal2高，这也印证了单糖转运蛋白具有自身独特的性质，外界糖浓度的高低启动不同单糖转运蛋白的表达.由此可以看出，酵母单糖转运蛋白并非具有严格的底物特异性，与其结构相似的单糖均可以被转运，只是底物的亲和力大小不同，反映出转运速率的差异，要根据实际应用选择与底物亲和力高的单糖转运蛋白.

影响单糖转运蛋白与糖亲和力的因素均为复杂.研究发现，酵母单糖转运蛋白中的12个疏水跨膜螺旋中的 3、5、7、8、11 与底物的结合有关，一些芳香族氨基酸的残基与葡萄糖或木糖结合.对MFS超家族基因GLUT1的研究中发现了一些影响转运蛋白功能的活性位点，但还没有发现一个氨基酸残基的突变直接会给葡萄糖结合带来严重影响的位点.通过定点突变的实验发现，Asn34、Ser66、Thr295、Thr310在胞外与结合糖的能力相关.突变第2和第4跨膜结构域的氨基酸残基（Gly75、Gly130），发现突变后的糖转运蛋白的底物结合空间不协调，影响了糖的结合.

对酿酒酵母单糖转运蛋白H XT2和Gal2的研究中发现，C末端由101个氨基酸组成的区域起到对不同底物——葡萄糖、半乳糖的识别作用[10]，Kasahara将hxt2和gal2基因决定第10个疏水跨膜螺旋的12个氨基酸随机突变，得到25 000种组合在含有半乳糖的平板中进行功能验证，发现芳香族氨基酸残基（Tyr446、Trp455）与底物的结合有关，将此残基用另19种必需氨基酸取代，Gal2转运半乳糖的活性只有突变前的20%，有的丧失了转运半乳糖的能力.酿酒酵母己糖转运蛋白Hxt2的研究也发现了影响底物识别的残基，位于蛋白质氨基酸431处，不同的氨基酸也会给底物的识别带来明显的影响.

从上述研究结果中不难发现，糖和转运蛋白相互作用是依靠一定的残基（芳香族氨基酸）之间的氢键形成一定的空间结构来维持的，以达到最佳的底物与转运蛋白的构象效果，这与酶的基本特性相似.近年来，为了提高木质纤维素水解液中单糖的转化效率，尤其是木糖的转化效率，对糖转运蛋白进行了一些改造，提高其对底物的亲和力.例如，采用定点突变的方法对树干毕赤酵母菌sut3基因和间型假丝酵母菌gxs1基因进行位点突变，SUT3、GXS1突变株在低浓度的葡萄糖和木糖中的生长能力相同，相比突变前提高了对木糖的利用效率[38]；Guillaume等[41]在研究提高酿酒酵母利用葡萄糖、果糖的转化效率中，对己糖转运蛋白HXT3在结构预测基础上，进行了10个位点的突变，突变后的HXT3蛋白显著提高了利用果糖发酵的能力.因此，改变单糖转运蛋白的底物结合位点，可有效促进单糖转运蛋白结合不同单糖的能力，这种基因工程手段已经成为目前单糖转运蛋白应用研究的热点.

5 展望

木质纤维素来源广泛，若能被充分利用，最有希望取代粮食和煤炭能源，成为生产生物基能源产品的主要原料.当前利用木质纤维素的瓶颈是水解液的转化效率低的问题，通过研究单糖转运蛋白可有效提高底物单糖的利用速率，进而增加生物基产品的生产效率，这一木质纤维素利用的攻克手段已受到越来越多研究者的重视.随着新的单糖转运蛋白不断被发现，对其后续的研究，如功能验证、结构解析、机理研究将显得尤为重要.因此，需要从分子生物学角度进一步深入研究单糖转运蛋白与底物结合的关系，尤其要通过对酵母单糖转运蛋白关键氨基酸残基位点的分析，实现对单糖转运蛋白的结构优化，从而有效提高底物与转运蛋白之间的亲和度；与此同时，还应当提高单糖转运蛋白结构的稳定性，及在不同糖浓度下的转运活性，以适应复杂多变的发酵环境.

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