李飞侠王 文朱 佳黄厚才夏 智

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.江苏省中医院，江苏 南京 210029；3.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

宣肺止嗽方为朱佳教授的经验方，由炙麻黄5g、杏仁10g、牛蒡子 10g、蝉衣 6g、白前 10g、桑白皮 10g、紫菀 10g、佛耳草15g、全蝎3g、炙甘草5g十味药组成，具有疏风宣肺、止嗽化痰之功效，主为感染后咳嗽（PIC）而设。感染后咳嗽的发病机制尚不甚明确，近年来国内外大多数学者认为PIC的发病机制与气道神经源性炎症关系密切[1-3]，其中最主要的是神经肽 P 物质（SP）、神经肽 A（NKA）、神经肽 B（NKB）、降钙素基因相关肽（CGRP）增高介导的气道慢性神经源性炎症。本实验应用动物模型就该方对气道神经源性炎症的作用机理做一些药效学探索研究，以气道炎症改变及SP、NKA、NKB、CGRP等作为考察指标，旨在从现代医学的角度，更好地挖掘该方的临床应用价值。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性纯白SD大鼠60只（购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司），体重180～220g，动物许可证号为SCXK2010-0001。

1.2 药物配制 宣肺止嗽方由江苏省中医药研究院中药制剂室制备。制备工艺：取麻黄，加水提取2次，每次加药材10倍量水，提取1h，合并提取液，静置12h，取上清液，减压浓缩，浸膏放置备用；另取蝉衣、杏仁、牛蒡子、白前等其余9味，加水提取2次，每次加药材10倍量水，提取1h，合并提取液，静置12h，取上清液，减压浓缩，浸膏与上述浸膏合并，继续浓缩至每毫升相当于2.604g生药的浸膏，作为样品液。惠菲宁止嗽糖浆，惠氏制药有限公司生产，批号：1107016。

1.3 主要试剂与仪器 内毒素（LPS）、辣椒素（Cap）购自美国 Sigma公司；SP、NKA、NKB和 CGRP酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，购自美国R&D公司，批号为 201211。Devilbiss 646型雾化器，购自美国Devilbiss公司，输出流量为0.037mL/min，输出口与双室透明塑料盒的头室相连接；TP-603T型传感器，购自日本光电公司；华东电子DG5033A酶标仪，购自南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；HH-4数显恒温水浴锅，购自国华电器有限公司；LOZ5-2型离心机，北京医用离心机厂；BH-2型Olympus生物显微镜（JAPAN）。

2 实验方法

2.1 动物分组及感染后咳嗽模型制备 将60只SPF级雄性纯白SD大鼠随机分为6组，即空白组、模型组、阳性对照组（惠菲宁8mL/kg）和宣肺止嗽方低剂量（4.71g/kg）、中剂量（9.42g/kg）、高剂量（13.86g/kg）组，每组 10 只。造模方法按本课题组前期有关制作感染后咳嗽动物模型的研究，参照文献[4-6]，略有改进，具体方法：除空白组以外其余各组大鼠置于特制的0.5m3烟室中，以锯屑末50g+10支南京牌香烟点燃烟熏，每日熏烟30min，连续10d，每日1次。自由进食、饮水。第11、14、17天用乙醚浅麻醉该5组大鼠后，鼻腔滴入浓度为0.4mg/mL的LPS溶液，滴入量以体重 1μL/g 计算。第 12、13、15、16、18天， 将该 5组大鼠置于透明密闭容器中以1×10-4mol/L的辣椒素溶液雾化吸入激发，每次3min，每日1次。每日观察各组大鼠状态，并于第19天开始各组大鼠按10mL/kg的体积灌胃相应药物，空白组给予等体积生理盐水，每日1次，连续给药15d。于最后1次灌胃后24h处死各组大鼠测定相关指标。

2.2 支气管肺泡灌洗液中速激肽及细胞分类计数 将大鼠平放于手术台上，将气管连同心肺游离出置于台上，用血管夹夹闭右主支气管，将顶端钝圆有孔的特制硅胶管插入气管，手术线结扎固定。左侧肺给予预温37℃的生理盐水行支气管肺泡灌洗，反复抽推3次，留置

1min后回抽BALF并收集，重复3次，每次2mL，每次回收液体置于冰块上，经过两层无菌纱布过滤于无菌离心管，回收计量（回收率约75%）。1500r/min低温离心10min，BALF上清保存在-80℃冰箱中，ELISA法检测速激肽SP、NKA、NKB及CGRP的含量。沉淀细胞用0.5mL PBS重悬，吹打均匀后取30μL在血细胞计数器下进行白细胞总数计算；另取30μL制作细胞涂片，常规HE染色，光学显微镜下按细胞形态进行分类计数（至少计数200个细胞），求出百分比。

2.3 肺组织病理学观察 气道灌洗完成后，迅速取下各组大鼠右肺，并取出右上叶修剪成0.5cm厚的块状，置于4%多聚甲醛固定6h，常规石蜡包埋切片，HE染色，观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况。

2.4 统计学方法 采用SPSS16.0进行数据统计分析。各组结果以（）表示。组间比较用t检验（方差齐性），方差不齐时用t’检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠BALF中细胞分类计数 结果显示，各治疗组与模型组相比，BALF中各炎症细胞比率均降低，以宣肺止嗽方中剂量组最为显著。见表1。

3.2 各组大鼠BALF中速激肽SP、NKA、NKB及CGRP含量结果显示，与空白组比较，模型组各项指标均显著升高；各治疗组BALF中各项指标均较模型组降低，以宣肺止嗽方中剂量组最为显著。见表2。

3.3 肺组织病理变化 空白组：可见支气管上皮细胞完整，细胞呈假复层柱状纤毛上皮，排列整齐，肺泡上皮完整，无明显病理改变（见图1-A）。模型组：可见支气管上皮大面积坏死脱落，细支气管管腔扩大，管壁及其周围见大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，上皮细胞明显增生，杯状细胞增生，肺泡间隙稍增厚，未见明显的炎症细胞浸润（见图1-B）。阳性对照组：支气管上皮细胞多灶坏死、脱落，伴上皮细胞轻度增生和杯状细胞增生，管壁增厚，伴大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，肺泡结构未见明显损伤（见图1-C）。宣肺止嗽方低剂量组：可见支气管上皮细胞少量的坏死脱落，管壁与周围淋巴细胞、中性粒细胞浸润，管腔无明显扩张，上皮细胞无明显增生（见图1-D）。宣肺止嗽方中剂量组：各级支气管上皮细胞基本完好，无明显的坏死和增生，伴少量的淋巴细胞浸润，肺泡间隙稍增厚，无明显炎症细胞浸润（见图1-E）。宣肺止嗽方高剂量组：可见支气管上皮细胞中度的坏死脱落，上皮细胞轻度增生，管壁稍增厚，伴淋巴细胞、中性粒细胞浸润，管腔轻度扩张，肺实质未见明显损伤（见图1-F）。

表1 各组大鼠BALF中细胞分类计数（）

表1 各组大鼠BALF中细胞分类计数（）

注：与空白组比较，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。

组别 动物数（只）剂量（g/kg）白细胞总数（×108/L）空白组10巨噬细胞（%）3.8±1.5淋巴细胞（%）82.32±2.34中性粒细胞（%）嗜酸粒细胞（%）10.78±1.40 6.69±1.510.21±0.077.2±1.5▲▲▲宣肺止嗽方高剂量组 10 13.86g/kg 5.4±1.5* 78.33±3.72*** 13.58±2.37*** 8.07±1.36*** 0.32±0.13模型组 10 66.67±2.50▲▲▲ 21.62±2.13▲▲▲ 11.32±1.48▲▲▲ 0.39±0.15▲▲宣肺止嗽方中剂量组 10 9.42g/kg 3.9±1.4*** 81.93±2.54*** 10.93±1.37*** 6.8±1.55*** 0.24±0.11*宣肺止嗽方低剂量组 10 4.71g/kg 4.2±1.3*** 79.40±2.70*** 12.50±1.38*** 7.71±1.79*** 0.40±0.16阳性对照组 10 8mL/kg 5.9±1.2 72.98±3.12*** 15.73±1.50*** 10.47±1.53 0.33±0.09

表2 各组大鼠BALF中速激肽含量（）

表2 各组大鼠BALF中速激肽含量（）

注：与空白组比较，▲▲▲P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

组别 动物数（只）剂量（g/kg）CGRP含量（pg/ml）160.97±9.6410 SP含量（ng/L）NKB含量（ng/L）空白组模型组 10 232.65±7.10▲▲▲ 73.66±2.98▲▲▲宣肺止嗽方高剂量组 10 13.86g/kg 225.73±3.79* 71.42±1.72宣肺止嗽方中剂量组 10 9.42g/kg 160.56±20.25*** 52.63±1.48***宣肺止嗽方低剂量组 10 4.71g/kg 176.82±21.02*** 59.92±2.16***阳性对照组 10 8mL/kg 228.51±5.05 72.32±1.96 NKA含量（ng/L）158.22±6.85 214.60±13.62201.24±7.00▲▲▲ 279.92±8.25▲▲▲190.74±6.35** 269.86±8.67*157.82±7.32*** 209.83±25.38***170.84±4.73*** 234.22±23.74***195.52±3.90* 269.40±13.5351.13±2.19

4 讨论

感染后咳嗽（PIC）是一种较为常见的呼吸道疾病。在美国ACCP协会2006年版 《咳嗽的诊断和治疗指南》和中国2009年版《咳嗽的诊断和治疗指南》中，均独立将感染后咳嗽归为亚急性咳嗽。目前普遍认为，由支气管肺C纤维兴奋导致其含有的神经肽的释放引起的神经源性炎症在感染后咳嗽发病中起重要作用[7]。当C纤维受到刺激，产生神经冲动，激发神经递质释放，从而作用于多种效应细胞，产生神经源性炎症，进而刺激RARs引起咳嗽[8-9]。所释放的神经递质主要包括P物质、神经肽A、神经肽B及降钙素基因相关肽等，它们通过多种形式影响气道组织诱发神经源性炎症。SP作为气道神经源性炎症的核心介质，在炎症疾病中的作用目前已经非常明确[10]。现代医学尚缺乏治疗该病公认有效的药物，而相关文献报道中医药对感染后咳嗽有较好的疗效，但有关中药如何影响本病相关发病机制的研究较少。

本实验采用小剂量内毒素（LPS）诱导模拟革兰阴性菌感染的方法创建PIC动物模型，统计结果显示：与空白组比较，模型组BALF中各类炎症细胞比率均显著升高，上清液中SP、NKA、NKB及CGRP含量均显著升高，结合肺组织病理学改变，可证实该模型复制成功。本研究发现，各治疗组大鼠BALF中各类炎症细胞比率均降低，以宣肺止嗽方中剂量组最为显著，其次为低剂量组；各治疗组BALF上清液中 SP、NKA、NKB及CGRP含量均较模型组降低，以宣肺止嗽方中剂量组降低最为显著。

综上所述，感染后咳嗽的发病与神经递质（以SP、NKA、NKB及CGRP为主）介导的神经源性炎症有关，这与大部分的研究结果相似。宣肺止嗽方能降低此类神经递质的含量，缓解气道炎症，促进疾病的恢复，其中尤以中剂量作用显著，其次为低剂量，而该方高剂量疗效不佳，可能是因为药物浓度过高存在一定程度的药物毒性。西药惠菲宁对降低此类神经递质含量及缓解气道炎症无显著作用。结合肺组织病理学改变，本研究进一步证实了该方对感染后咳嗽良好的治疗效果，并初步探讨了相关作用机理，为该方的临床应用提供科学合理的实验依据，并提示中药复方具有潜在的临床应用前景。

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