陈 丽，杜永亮，贾晓民，李海泉，赵 杰，杨珊珊，徐永红(徐州医学院第二附属医院呼吸科，徐州 221006)

人胰岛素生长因子受体1(insulin-like growth factor receptor-1，IGF1R)在多种肿瘤组织中过度表达，与肿瘤增殖、转移及凋亡关系密切［1］;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是刺激肿瘤血管生成重要的促生长因子，受缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)水平的调节［2］。目前研究表明，抑制IGF1R表达能显著降低VEGF水平，减少肿瘤血管生成，抑制肿瘤增殖［3］。本研究从体内实验的角度，以慢病毒为载体的RNA干扰技术沉默人肺腺癌A549细胞IGF1R表达，观察其对裸鼠移植瘤生长抑制及 HIF-1α、VEGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 慢病毒、细胞株及靶序列 慢病毒载体系统(pGC-LV、pHelper 1.0 、pHelper 2.0)购自上海吉凯基因技术有限公司;IGF1R shRNA靶序列5’-CAACGGCCTATTGTCAGGT-3’，阴性对照序列:5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，由本课题前期验证［4］;人肺腺癌A549细胞株购自中科院上海细胞研究所，保存于徐州医学院肿瘤学重点实验室。

1.1.2 实验动物 3-5周龄的BALB/c雄性裸鼠18只，体重16-18 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(动物合格证号 SCXK(沪)2012-0002);饲养于徐州医学院实验动物中心SPF级环境，饲料及水均自由摄入且均经过严格的灭菌处理。

1.1.3 主要试剂 DMEM及胎牛血清均购自美国Gibco公司;HIF-1α、VEGF PCR引物由上海生工设计并合成;荧光实时定量PCR试剂盒购自北京天根公司;兔抗人IGF1R单克隆抗体购自Santa公司;鼠抗人CD34单克隆抗体及免疫组化试剂盒(S-P法)购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染A549细胞 取对数生长期A549细胞，调整细胞密度2.5×104个/ml，取2 ml分别接种于6孔板，培养条件:含10%胎牛血清的DMEM培养基，含5%CO2、37℃及饱和湿度的培养箱。用台盼蓝染色法计算细胞成活密度约30%-40%时(细胞成活率/%=4大格活细胞数/4大格总细胞数×100%)，加入以感染复数MOI为20病毒量进行感染效果最佳［4］。24 h后更换原培养液继续培养，72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况及细胞状况，GFP基因由慢病毒骨架质粒所携带，病毒只有感染目的细胞后，才可能利用细胞内成分合成GFP蛋白，即细胞如表达绿色荧光蛋白提示已经被重组慢病毒感染。计算感染效率，取感染效率大于90%细胞用于裸鼠成瘤实验。

1.2.2 移植瘤裸鼠模型的建立 将18只裸鼠随机分为三组:空白对照组、阴性对照组及实验组。分别取A549细胞及相应的病毒感染后的A549细胞，胰酶消化后，离心去上清液，PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞密度为2.0×107/ml;分别取上述制备的细胞悬液0.1 ml接种于裸鼠右腋皮下，观察肿瘤形成情况，瘤体直径至0.3 cm时为移植成瘤;每3 d用卡尺测量瘤体长径(a)及短径(b)，依据公式VT=1/2ab2计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，依据公式P=(1-实验组瘤体体积/空白对照组瘤体体积)×100%计算体积抑瘤率;28 d后颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，分离瘤组织，称重，依据公式P=(1-实验组瘤重/空白对照组瘤重)×100%计算质量抑瘤率;肿瘤组织部分保存于液氮，部分用10%中性甲醛溶液固定后行HE染色及免疫组化检测。

1.2.3 Western blot法检测移植瘤组织IGF1R蛋白表达 取移植瘤组织80 mg，加裂解缓冲液后研磨匀浆，4℃ 12 000×g离心，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度，取80 μg样品蛋白行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法将蛋白转至NC(硝酸纤维素)膜上，5%脱脂奶粉液封闭2 h，兔抗人IGF1R一抗(1∶300稀释)孵育4℃过夜，二抗室温孵育2 h，BCIP/NBT(四唑氮蓝/5-溴4-氯-3吲哚，磷酸盐)碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色并拍照。应用Image-J软件分析图像并计算蛋白沉默效率。蛋白沉默率(%)=(1-实验组IGF1R蛋白相对表达量/对照组IGF1R蛋白相对表达量)×100%。

1.2.4 荧光实时定量PCR法检测移植瘤组织HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达 取移植瘤组织80 mg，Trizol法抽提总RNA，按照试剂盒说明完成第一条链cDNA的合成。

荧光实时定量 PCR引物序列:HIF-1α上游5’-AGAAGACGTGCAGGGACCCC-3’，下游 5’-AGAAGATTTGCAGGGACCCC-3’;VEGF上游5’-AAGATCCGCAGACGTGAAATGTT-3’，下游 5’-CGGCTTGTCACATCTGCAAC-3’;β-actin上游5’-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3’，下游 5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’;反应条件:95℃90 s，94℃15 s，60 ℃100 s(包含荧光读取30 s)，68℃90 s，共40个循环;依据荧光曲线，计算出Ct值。基因mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算分析。

1.2.5 移植瘤组织HE染色 移植瘤组织石蜡包埋后，4 μm连续切片;经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水处理后，苏木素-伊红染色，封片显微镜下观察组织形态。

1.2.6 免疫组化法测定微血管密度 以CD34为检测标的物，采用免疫组织化学SP法。移植瘤石蜡包埋，5 μm连续切片;二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化;3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶;EDTA修复;羊血清室温封闭1 h;兔抗人IGF1R一抗(1∶300稀释)4℃孵育过夜;PBS清洗，加入二抗，室温孵育0.5 h，冲洗后DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片;用已知肺腺癌免疫组化切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。参照Weidner［5］报道方法，先用40倍光镜在肿瘤组织中寻找高血管密度区，应用计算机辅助的图像系统以5个随机200倍视野内被CD34染成棕色的血管的均数表示该组织的微血管密度(MVD)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 移植瘤模型建立及生长情况

以MOI为20病毒量感染A549细胞72 h后感染效率达90%-95%水平(图1，见第751页);空白对照组、阴性对照组及实验组裸鼠均成瘤，成瘤率100%;三组成瘤时间分别为 9.3，9.7，12.8 d，实验组裸鼠成瘤时间明显推迟(P＜0.05)，空白对照组(627.6±124.6)mm3、阴性对照组(585.1±142.1)mm3、实验组(316.4±19.7)mm3，实验组肿瘤生长受到显著抑制，体积抑瘤率达(50.14±2.58)%，质量抑瘤率达(55.53±3.11)%。空白对照组及阴性对照组间无显著差异，绘制肿瘤生长曲线(见图2)。

图2 不同条件下裸鼠移植瘤生长曲线Figure 2 Growth curve of nude mice xenograft in three groups

2.2 移植瘤组织IGF1R蛋白表达

空白对照组、阴性对照组及实验组移植瘤组织IGF1R蛋白相对表达量分别为0.82±0.05、0.80±0.05、0.25±0.01，实验组IGF1R表达量较两组对照组显著降低(P＜0.05)，沉默效率为70.66%，两对照组间无显著差异(P＞0.05，见图3)。

图3 Western blot检测不同条件下移植瘤组织IGF1R蛋白的表达Figure 3 IGF1R protein expression in xenograft in three groups by Western blot

图1 慢病毒感染A549细胞 (×100)Figure 1 The A549 cells infected by lentivirus for 72 h (×100)

图4 不同条件下移植瘤HE染色镜下表现 (×200)Figure 4 Morphology of xenografts under a microscope by HE staining (×200)

图5 不同条件下移植瘤组织MVD免疫组织化学染色镜下表现 (×100)Figure 5 MVD of xenografts under a microscope by immunohistochermical staining (×100)

2.3 移植瘤组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达

空白对照组、阴性对照组及实验组移植瘤组织HIF-1α mRNA和VEGF mRNA相对表达量分别为0.72±0.03、0.68±0.04、0.34±0.02和 1.08±0.06、1.00 ±0.07、0.46 ±0.04，实验组 HIF-1α 和VEGF基因水平表达量与对照组比较，呈显著下降(P＜0.05)，两对照组间无显著差异(P＞0.05)。

2.4 移植瘤组织HE 染色及微血管密度测定

在移植瘤组织HE染色切片上，对照组肿瘤组织细胞体积大、胞质丰富、核/浆比例大、染色深、分裂相多见、癌巢大、细胞丰富、排列紧密、间质稀少，包膜多不完整。而实验组瘤组织细胞较少、细胞分界清、癌巢小、间质丰富、包膜相对完整，并可见片状的部分细胞核与浆呈固缩坏死样改变(图4，见第751页)。

微血管密度(MVD)检测移植瘤组织内不同区域的微血管计数不同，形态不规则，部分血管无明显管腔(图5，见第751页)，三组MVD分别为28.2±0.03、32.8±0.05、10.2 ±0.04，实验组 MVD 显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

RNA干扰是利用同源性双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默现象。小干扰RNA及pSUPER载体质粒技术可有效、特异性地沉默细胞内目的基因的表达，为RNAi技术在基因治疗研究中奠定了基础。但由于其转染率较低、基因抑制表达作用较弱、持续时间较短、不适合体内实验等缺点，限制了其研究应用［6］;腺病毒载体虽然能够提高转染效率，但其免疫原性大、外源基因表达的可控性差等因素限制，体内研究效果并不理想［7］;近年来出现的慢病毒载体具有携带基因容量大、外源基因表达稳定且时间长、感染效率高(可以感染体内、体外分裂细胞与非分裂细胞)、免疫原性低、安全性高等优点，成为RNAi技术体内研究最理想的载体［8］。本课题组构建的IGF1R-shRNA重组慢病毒可有效沉默肺腺癌A549细胞IGF1R表达，在前期体外实验研究中已得到证实［4］。本研究再次证实，该重组慢病毒对A549细胞移植瘤组织IGF1R同样具有较高的抑制效率，且无红肿、硬结或溃烂等局部免疫排斥现象。

IGF1R是酪氨酸受体家族重要的成员之一，与配体IGFs结合后，可在其他生长因子缺乏的情况下促使细胞周期的完成，具有较强的促进细胞增殖作用。许多研究已证实，IGF1R在肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤组织中过表达;并参与肿瘤细胞恶性表型转化，促进肿瘤增殖。Wang等研究表明下调IGF1R表达对肺腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用［9］。但其具体作用机制尚未完全明确。

乏氧是肿瘤组织生长重要的特征之一。HIF-1α是乏氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种核转录因子，HIF-1α蛋白通过逃逸泛素化蛋白酶水解而组成性激活;血管依赖是肿瘤组织生长的另一重要特征。VEGF是重要的促血管生成因子，它能特异性地结合血管内皮细胞，促进内皮细胞生长，促使血管的生成。而HIF-1α/VEGF轴在肿瘤血管生成中的作用已逐渐得到证实。HIF-1α不仅可以促进VEGF的转录，而且可以增加VEGF mRNA的稳定性，促进VEGF蛋白的表达［10］。

近年来研究发现，IGF1R参与了肿瘤组织血管的生成过程。Piecewicz等证实，IGF1R通过MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT细胞信号通路促进核因子HIF-1α表达，进而提高胚胎干细胞VEGF表达水平［11］;Gariboldi等研究表明，IGF1R 抑制剂 NVPAEW541能通过IGF-STAT3-HIF1信号通路抑制胶质瘤细胞VEGF表达［12］。本研究中，当IGF1R沉默后，肺腺癌移植瘤组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达均显著降低，微血管密度显著减少，肿瘤细胞稀疏，细胞间质丰富;移植瘤的体积减小、重量减轻，移植瘤生长受到显著抑制，再次证实了IGF1R信号通路在核因子HIF-1α表达及血管生成中的重要作用。

综上所述，以慢病毒为载体的IGF1R基因干扰能显著降低肺腺癌组织血管生成，抑制肿瘤生长，且高效、安全。

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