谭远贞，邵夏炎,徐淑梅，张奇志

（1.天津医科大学生理学教研室，天津300070；2.复旦大学药学院药剂学教研室，上海201203）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以老年斑和神经元纤维缠结为特征的神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并伴有各种神经精神症状和行为障碍。前期大量实验研究表明H102肽是一个极具前景的治疗AD新药[1-2]。由于H102肽体内稳定性差，频繁注射给药会给老年患者带来很大负担，不利于临床的应用。目前，输送蛋白多肽类药物的纳米释药系统得到较广泛的研究，聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）是目前最为成功地应用于药物载体的生物可降解聚合物，但单纯PLGA纳米粒容易被网状内皮系统吞噬，而其表面经聚乙二醇（PEG）修饰后能显著地避开网状内皮系统吞噬从而在体内达到长循环的作用[3]。由于胞吞转运机制能够介导纳米粒载药系统转运入脑，而单纯纳米粒主要是起到防止药物迅速被体内酶降解及缓慢释药的作用，其诱导脑毛细管内皮细胞的胞吞作用小，限制了药物生物利用度的进一步提高。据文献报道，经聚山梨醇酯80修饰的纳米粒能增加穿透血脑屏障入脑量[4]。王华芳等[5]对PLA纳米粒示踪标记，证实了聚山梨醇酯80修饰的PLA纳米粒具有穿透血脑屏障的特性，机制可能是毛细血管内皮细胞的胞吞转运作用。为提高H102肽纳米粒脑内靶向性，本文在前期工作的基础上，制备聚山梨醇酯80修饰H102聚乳酸-羟基乙酸纳米粒，并进行体内脑靶向性研究和细胞毒性的安全性评价。

1 材料与方法

1.1 材料 乙腈（色谱纯，TEDIA Company，USA）；甲酸（色谱级，TEDIA，美国）；醋酸安普利肽（纯度> 98.5%，大连美仑生物技术有限公司）；H102肽纳米粒（自制）；安捷伦液质联用仪(Agilent 1100series LC/MSD，美国)；氮吹仪(MD200-2，杭州奥盛仪器有限公司)；ICR小鼠（雄性，体质量24～26g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱和质谱条件 色谱柱：Agilent XDB C18（21mm×50mm，5μm），保护柱：Phenomenex C18（4.0mm×3.0mm，5mm），流动相：乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）=14.5∶85.5，V/V，流速：0.4mL·min-1，柱温：40℃。电喷雾离子源（ESI），正离子模式（SIM+），离子通道选择：H102肽为[M-H]+，m/z 645.3；安普利肽为[M-H]+，m/z 843.2。毛细管电流：2000nA，离子源温度：100℃，干燥气流速：3.0L·min-1。

1.2.2 生物样品处理 （1）血浆样品：取血浆样品100μL，加入10μL安普利肽溶液（内标，浓度2μg· mL-1）及300μL乙腈，涡漩2min，12000r·min-1、4℃离心15min，取上清液100μL氮气吹干，用100μL流动相复溶后，离心、取上清液10μL LC-MS进样分析。（2）脑组织样品：按照1:2重量比加入0.1%甲酸水，进行冰水浴匀浆。将匀浆液于4000r·min-1、4℃离心3min，取上清液150mL加入10mL内标及300mL乙腈，涡旋2min，12000r·min-1、4℃离心15min，取上清液300μL氮气吹干，用50μL流动相复溶后，离心、取上清液10μL LC-MS进样分析。

1.2.3 标准曲线的制备 （1）血浆标准曲线：精密移取500μg·mL-1H102肽储备液，稀释成100、40、20、10、4、2、1和0.4μg·mL-1工作液，取以上浓度H102肽50μL，加入50μL空白血浆，使H102肽终浓度为 50、20、10、5、2、1、0.5和 0.2μg·mL-1，按“1.2.2”项下方法处理，LC/MS测定。(2)脑匀浆液标准曲线：精密移取500μg·mL-1H102肽储备液，稀释成300、150、75、37.5、18.75和9.375ng·mL-1工作液，取以上浓度H102肽50μL，加入100μL空白脑匀浆液，使H102肽终浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125ng·mL-1，按“1.2.2”项下方法处理，LC/ MS测定。

1.2.4 方法回收率和精密度 分别配制含低、中、高3个浓度的血浆和脑匀浆液H102肽样品溶液各5份，按“1.2.2”项下方法处理，在1d内测完，之后每天各浓度配制1份样品，连续测定5d，考察精密度。分别配制含低、中、高3个浓度的对照样品，即加入相应体积的超纯水稀释成相应的浓度，按“1.2.2”项下方法处理，LC/MS测定。记录峰面积，以两者的比值计算回收率。

1.2.5 动物实验 取ICR小鼠48只，随机分成2组，分别按照H102肽的给药剂量为4mg·kg-1尾静脉注射H102-NP（注射前用0.9%生理盐水分散）和PS-H102-NP溶液（注射前用1%聚山梨醇酯80分散）。于给药后5、15、30、45、60和120min眼眶取血并心脏灌流分离脑组织，每时间点重复做4只小鼠，样品按“1.2.2”项下方法处理后置-20℃冷冻保存，48h内测定。

1.2.6 细胞毒性评价 取对数生长期的BCECs细胞，胰酶消化并吹打为细胞悬液。细胞计数后调整悬液细胞浓度为1×105/mL，取100μL细胞悬液接种到96孔板，置37℃，5%CO2的孵箱中培养24h后，弃去培养液。HBSS洗两遍后分别加入以下用无血清DMEM配制的聚山梨醇酯80（polysorbate 80，PS）：16%、8%、4%、2%和1%；单纯纳米粒：12.5、25、50和 100mg·mL-1；含 1%聚山梨醇酯 80（polysorbate 80,PS）纳米粒：12.5、25、50和100mg· mL-1。每组设定6个复孔，同时设置调零孔和阴性对照孔。分别孵育4、24h后，去掉培养液，加100μL MTT（1.25mg·mL-1）继续培养4h后，小心吸掉上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪492nm处测量各孔的吸光值。根据以下公式计算细胞存活率：

1.3 统计学处理 实验结果采用SPSS16.0统计软件进行分析，组间差异采用t检验法。

2 结果

2.1 标准曲线 （1）血浆标准曲线：以H102肽和内标的峰面积比值R为纵坐标，H102肽浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=15.654x-14.78，r=0.9989，表明H102肽浓度在0.2～50μg·mL-1范围内线性关系良好。（2）脑匀浆液标准曲线：以H102肽和内标的峰面积比值R为纵坐标，H102肽浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y= 0.0233x-0.0062，r=0.9997，表明H102肽浓度在0.3125～100ng·mL-1范围内线性关系良好。

2.2 方法回收率和精密度 血浆中低、中、高3个浓度的回收率分别为89.2%、91.1%和84.2%，日内和日间的精密度均小于4.4%。脑匀浆液中低、中、高3个浓度的回收率分别为90.2%、92.5%和87.6%，日内和日间的精密度均小于5.3%。

2.3 药时曲线 H102-NP和PS-H102-NP小鼠静脉注射后，H102肽在血和脑组织中的药－时曲线见 图1。

图1 小鼠尾静脉注射H102-NP和PS-H102-NP后在血浆和脑组织中的药－时曲线Fig 1 Concentration-time curves of H102in plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

由图1可知，静脉注射H102-NP和PS-H102-NP后，脑组织中H102肽的浓度均在30min达峰，且在45min时仍维持较高的浓度。在相同时间点里，后者脑组织中的H102肽的浓度都较前者高。采用药动学软件DAS2.0对药物浓度数据进行处理，H102-NP和PS-H102-NP在血浆和脑组织中的药动学参数见表1。可见，PS-H102-NP在脑内的半衰期和滞留时间都延长，清除率下降，AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有较佳的脑靶向性。

表1 小鼠尾静脉注射H102-NP和PS-H102-NP后在血浆和脑内的药动学参数Tab 1 Pharmacokinetic parameters of plasma and brain after intravenous injection of H102-NP and PS-H102-NP in mice

2.4 细胞毒性评价 不同浓度的聚山梨醇酯80和纳米粒分别作用于BCECs细胞4h和24h后，细胞的存活力情况见图2、3。

图2 不同浓度聚山梨醇酯80对细胞活力的影响Fig 2 Cell viability of various concentration of polysorbate 80on BCECs

图3 不同浓度H102-NP和PS-H102-NP对细胞活力的影响Fig 3 Cell viability of various concentration of H102-NP and PS-H102-NP on BCECs

由图2可知，不同浓度聚山梨醇酯80孵育2h后，8%以上时对细胞有一定的毒性，而浓度在4%以下时细胞活力仍有80%以上，而孵育24h后，4%的浓度显示出了较大的毒性，细胞活力下降到23%，而2%浓度对细胞毒性仍很小，细胞的活力仍达90%，故浓度为2%以下的聚山梨醇酯80具有较佳的安全性。由图3可知，H102-NP和PS-H102-NP孵育4h后，细胞活力均随浓度的增加有所下降，但细胞活力仍在80%以上，具有较低的毒性，两者的差异（P>0.05）不具有统计学意义。在孵育24h后，浓度为12.5mg·mL-1H102-NP组和PS-H102-NP组细胞活力仍有80%以上，毒性较低，两者的差异（P>0.05）不具有统计学意义。而25mg·mL-1和50mg·mL-1H102-NP组的细胞活力均降到70%左右，而对应浓度的PS-H102-NP组细胞的活力仍有80%以上，两者的差异（P<0.05）具有统计学意义，表明长时间孵育后，H102-NP对细胞表现出一定的毒性，而PS-H102-NP仍具有较佳的安全性。

3 讨论

药动学研究结果表明，PS-H102-NP能增加药物的入脑量，其在脑内的半衰期和滞留时间延长，清除率下降，且其AUC值是H102-NP的1.42倍，表明PS-H102-NP具有良好的脑靶向性。BCECs细胞是模拟血脑屏障的脑毛细管内皮细胞模型，纳米粒透血脑屏障的机制可能是通过细胞的胞吞作用。细胞毒性结果表明，聚山梨醇酯80具有较好的安全性，且经其包衣的PS-H102-NP对细胞的毒性较未包衣的H102-NP小，表明PS-H102-NP具有较佳的安全性，其入脑量的增加不是通过破坏血脑屏障的途径而增加的。低密度脂蛋白受体是纳米粒被脑毛细管内皮细胞摄取的重要因素，PS-H102-NP在体内可能会与血浆中的载脂蛋白结合，而被低密度脂蛋白受体识别摄取入脑[6]。本实验研制的PSH102-NP具有良好的脑靶向性和低毒性，为该剂型应用于阿尔茨海默病的治疗提供了实验依据，同时对需要脑靶向治疗的药物剂型开发具有重要的指导意义。

［1］ 马志红，徐淑梅.H102对Aβ致神经元毒性的保护作用[J].天津医药杂志，2008，36（3）:198

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