华金玲 王立克 杨 芝 刘明明

(安徽科技学院，凤阳，233100)

甲烷是与全球气候变化密切相关的温室气体，其温室效应是二氧化碳的62 倍。反刍动物瘤胃发酵产生的甲烷通过嗳气排入大气，全球每年反刍动物产生甲烷量约为77 t，占大气中甲烷总量的l5%，并且每年以1%的速度增加［1］。反刍动物甲烷气体排放造成的温室气体效应占到气候变暖因素作用的15% ～20%。因此，瘤胃甲烷菌的相关研究日益受到人们的关注，并进行了广泛深入的研究。瘤胃产甲烷菌是一类严格厌氧的古菌，隶属广古菌门［2］。一般认为，瘤胃甲烷菌以甲烷杆菌科数量最多，其次为甲烷微菌科［3］。瘤胃甲烷菌对条件要求高，培养难度大，再加一些甲烷菌存在不可培养且无法记数等原因，截至目前，美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布全基因组测序序列的产甲烷古菌有22株［4］。因此，应用先进技术进行瘤胃甲烷菌的快速、准确、灵敏检测方法已成为瘤胃甲烷菌研究的发展方向。成艳芬等针对山羊瘤胃的真菌分离培养液分离出来的产甲烷菌进行16S rDNA 扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、RFLP 及测序分析，探讨山羊瘤胃真菌分离培养液中产甲烷菌的种类及其多样性，表明山羊瘤胃真菌培养液中的多数瘤胃产甲烷菌是迄今未知的种属［5］。Wright 等［6］利 用16S rRNA 基因库和DGGE 技术检测委内瑞拉绵羊瘤胃内的产甲烷菌，指出Methanobrevibacter 是其瘤胃的主要菌群。成艳芬等［7］利用ARISA 方法研究产甲烷菌共存及去除条件下瘤胃真菌多样性，建立了快速可行的厌氧真菌多样性分析方法。刘园园等［8］利用PCR－DGGE 探索水牛瘤胃产甲烷菌的多样性，获得较好地分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性。郭嫣秋［9］利用实时定量PCR 方法研究了产甲烷菌和微生物菌群与甲烷生成的密切关系，并建立了瘤胃产甲烷菌活性检测的实时定量PCR 检测技术［9］。本研究通过采集安徽本地黄淮白山羊瘤胃内瘤胃甲烷杆菌进行厌氧培养，并利用瘤胃产甲烷菌基因的特异性，进行引物设计，优化PCR 扩增条件，从而探索PCR 技术在安徽黄淮白山羊瘤胃产甲烷菌检测中的应用，并为建立快速、准确的瘤胃产甲烷菌检测技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 瘤胃甲烷杆菌的培养

1.1.1 瘤胃甲烷菌种的采集

黄淮白山羊屠宰后，及时取出瘤胃并在其上方开口将厌氧管深入瘤胃内部液体中，待其装满后迅速取出，放进事先调好温度的39 ℃保温瓶中，带回实验室进行甲烷杆菌的接种培养。

1.1.2 BRN 厌氧培养基

甲烷杆菌培养采用BRN 厌氧培养基参照德国DSMZ 微生物菌种保藏中心。

配制方法:①按顺序将A 溶液50 mL，B 溶液50 mL ，微量元素溶液10 mL，氯化铵1. 0 g，刃天青(0.1%)1 mL，乙酸钠2.5 g，甲酸钠2.5 g，酵母浸提物2.0 g，2－巯基磺酸钠0.1 mg，蛋白胨2.0 g，无细胞瘤胃液300 mL(新鲜瘤胃液采集后，12 000 r/min下离心15 min，取上清液，重复1 次)，溶于去离子水，并加水至1 000 mL，加热10 min 排出液体中的氧气;②持续通入CO2，冷却30 min;③待冷却后加入5.0 g 碳酸氢钠、0.5 g 九水合硫化钠、1.0 g L－半胱氨酸盐酸，使之溶解;④调整培养基的pH 到6.4 ～6.8;⑤在厌氧操作台上进行Hungate 管分装，每只Hungate 管装入9 mL 培养基，然后115 ℃灭菌20 min。其中A 溶液为6 g 磷酸氢钾，溶于蒸馏水并定容至1 000 mL，0 ～4 ℃保存，待用;B 溶液为6.00 g磷酸氢钾，6.00 g 硫酸铵，12.00 g 氯化钠，2.50 g 七水合硫酸镁，0.16 g 二水合氯化钙加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。

微量元素溶液为溶液1、溶液2 混合，并用1 mol/L 氢氧化钾调整pH 值至7。加去离子水，定容至2 000 mL。其中溶液1 为1.50 g 次氮基三乙酸溶于600 mL 蒸馏水中，3 mol/L 氢氧化钾调整pH 值至6.5;溶液2 为3.000 g 七水合硫酸镁，0.450 g 二水合硫酸锰，1.000 g 氯化钠，0.100 g 七水合硫酸亚铁，0.180 g 七水合硫酸钴，0.100 g 二水合氯化钙，0 . 180 g 七 水 合 硫 酸 锌，0. 010 g 五 水 合 硫 酸 铜，0.018 g 十二水合硫酸铝钾，0.010 g 硼酸，0.010 g二水合钼酸钠，0.100 g 六水合硫酸镍，0.190 g 硒酸钠，0.100 g 二水合钨酸钠，溶解于600 mL 去离子水中。

1.1.3 瘤胃甲烷菌的接种

利用1 mL 无菌注射器吸取采集的瘤胃菌种0.5 mL 于已灭菌的装有BRN 厌氧培养基的Hungate 管中混匀，在37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。

1.1.4 纯培分离接种

在1.1.3BRN 厌氧培养的基础上加入0.25%的琼脂，厌氧操作箱中分装于培养皿中。将Hungate管中培养48 h 的甲烷杆菌在厌氧操作箱中接种于培养皿中，并于48 h 涂片革兰氏染色生物显微镜(奥林帕斯)观察。

1.2 瘤胃甲烷杆菌的检测

1.2.1 引物设计

以产甲烷菌(Methanobrevibacte ruminatium)为检测对象，引物设计参照Denman 等，以甲基辅酶M还原酶基因(MCR)为扩增的目的片段，引物上游5'－TTCGGTGGATCDCARAGRGC－3'，扩增保守氨基酸序 列 FGGSQR，下 游5' － GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC－3'，扩增保守氨基酸序列GFYGYDL，扩增片段长度为140 bp，引物由上海生工生物合成。

1.2.2 基因DNA 的提取

采用CTAB 方法。取培养48 h 的甲烷杆菌于研钵中，加入800 μL CTAB 提取缓冲液(可依据量相应增加)，研磨10 min。然后在70 ℃水浴中温育20 min，10 000 r/min 离心10 min。保留上清液，并转移至空白离心管中，加入酚/氯仿500 μL，涡旋成白色乳浊液，然后13 000 r/min 离心10 min。吸取500 μL 上清液体于空白离心管中，并加入异丙醇300 μL，离心管轻轻上下反复倒置数次。室温下静置5 ～10 min 使DNA 沉淀，然后13 000 r/min 离心15 min。去除上清液后，可见呈灰色的DNA 沉淀。用1 mL 70%乙醇，洗涤沉淀，并70 ℃温育10 min，温育期间手指轻弹离心管洗涤沉淀。然后离心13 000 r/min，10 min。去除上清液，沉淀物在室温下干燥或烘箱中70 ℃干燥5 min。据沉淀物量多少可加入50 ～100 μL TE 重新悬浮沉淀，必要时可采用加热促进其溶解。

1.2.3 瘤胃甲烷菌PCR 检测

反应体系与扩增条件:采用30.0 μL 反应体系，即10×Buffer(NH4)2SO43.0 μL，MgCl21.8 μL，dNTP 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板5.0 μL，Tag 酶0.2 μL，加dd H2O 至30.0 μL。

PCR 的扩增条件:95 ℃，预变性，2 min;95 ℃，变性15 s，60 ℃，复性和延伸1 min，共40 个循环;10℃保温。

PCR 产物电泳检测:PCR 反应结束后，利用1.50%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。电泳检测利用EtBr 显色，EtBr 溶解于琼脂糖中，其终浓度为0.02 g/L。电泳时0.50% TBE 作为缓冲液，电压恒定在120 V。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察产物电泳结果，并将电泳结果拍摄保存。

2 结果与分析

瘤胃产甲烷菌在培养过程中需要添加酵母培养物、微量金属元素如镍、钴、铁等作为辅酶的组成。试验配制的BRN 厌氧培养基满足瘤胃甲烷杆菌的生长需求，相应的厌氧环境也适宜瘤胃甲烷杆菌的生长，因此，瘤胃甲烷杆菌革兰氏染色清晰可见(见图1)。

瘤胃甲烷菌培养48 h 后，利用分子方法进一步检验。结果表明，瘤胃产甲烷菌(Methanobrevibacte ruminatium)引物设计具有特异性、专一性，PCR 扩增条件参数设定合理、准确。PCR 结束后，扩增产物的凝胶电泳检测结果显示，扩增产物基因片段与目的片段相一致，扩增产物条带单一明亮，并且出现在140 bp 的位置(见图2)。

图1 瘤胃甲烷杆菌厌氧培养48 h 形态(10×100 倍电子显微镜下观察)

图2 PCR 扩增产物凝胶电泳图

3 结论与讨论

产甲烷菌中含有与甲烷生成密切相关的辅酶，如甲酰四氢甲基喋呤(THMP)、甲酰甲基呋喃(MFR)、辅酶F420(COF420)、辅酶M(HSCoM)、辅酶F430(COF430)以及辅因子B(HSHTP)等。瘤胃3 种甲烷生成方式最终都形成甲基辅酶M，甲基辅酶M 还原酶(MCR)是甲烷产生过程中的一个关键酶，存在于甲烷菌中，甲基辅酶M 在甲基辅酶M 还原酶I(MCR I)和甲基辅酶M 还原酶II(MCR II)的催化下最终形成甲烷［10］。其中MCR I 复合体的一个肽段mcrA 基因的编码是利用PCR 技术检测产甲烷菌的有效而稳定的手段。尤其是在产甲烷菌的分离鉴定方面具有很好的应用价值［11］。以mcrA 基因为目的片段的PCR 技术广泛应用于沼气发酵、海洋以及稻田等环境中产甲烷菌的检测。Springer 等［12］利用PCR 技术成功地分离鉴定了1 个已知的甲烷八叠球菌。Luton 等［13］改进mcrA 基因PCR 的引物，检测垃圾场内产甲烷菌的种类，并获得成功，证实了利用mcrA 基因检测甲烷菌的可靠性和稳定性。本试验设计的mcrA 基因的PCR 引物具有较强的专一性，在PCR 产物扩增后在引物对应的位置亮带明显。结果表明，目标甲烷菌在mcrA 基因引物设计、反应体系、扩增参数、引物设计等正确的条件下，其特异性基因片段扩增的要求可以得到满足，从而为黄淮白山羊瘤胃甲烷菌的进一步定量分析奠定了科学依据。

综上所述，本试验的BRN 厌氧培养基是瘤胃甲烷杆菌体外培养的理想培养基;以瘤胃甲烷杆菌甲基辅酶M 还原酶基因(MCR)为扩增的目的片段的引物(上游5'－TTCGGTGGATCDCARAGRGC－3'，下游5'－GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC－3')，具有特异性、专一性，PCR 扩增条件参数设定合理，扩增产物特异性高。本试验结果为黄淮白山羊瘤胃甲烷菌的检测奠定了一定的理论依据，从而使瘤胃中不可培养甲烷菌的定性、定量检测成为可能。

［1］ Moss A R，Jouany J P，Newbold J. Methane production by ruminants:its contribution to global warming［J］. Ann Zootech，2000，49(3):231－253.

［2］ Lange M，Ahring B K. A comprehensive study into the molecular methodology and molecular biology of methanogenic Archaea［J］.FEMS Microbiol Rev，2001，25(5):553－571.

［3］ Sharp R，Ziemer C J，Stern M D，et al. Taxon-specific associations between protozoal and methanogen populations in the rumen and a model rumen system［J］. FEMS Microbiol Ecol，1998，26(1):71－78.

［4］ 朱晨光，许政暟，宋任涛.产甲烷古菌［J］. 生命的化学，2009，29(1):129－133.

［5］ 成艳芬，毛胜勇，裴彩霞，等.共存于厌氧真菌分离培养液中瘤胃甲烷菌的检测及其多样性分析［J］. 微生物学报，2006，46(6):879－883.

［6］ Wright A D G，Ma X L，Obispo N E. Methanobrevibacter phylotypes are the dominant methanogens in sheep from Venezuela［J］.Microbial Ecology，2008，56(2):390－394.

［7］ 成艳芬，朱伟云.ARISA 方法研究产甲烷菌共存及去除条件下瘤胃真菌多样性变化［J］.微生物学报，2009，49(4):504－511.

［8］ 刘园园，姜伟伟，秦红玉，等.PCR－DGGE 技术在水牛瘤胃产甲烷菌多样性分析中的应用［J］. 南方农业学报，2011，42(9):1144－1147.

［9］ 郭嫣秋.瘤胃产甲烷菌定量检测与微生物菌群调控研究［D］.杭州:浙江大学，2008.

［10］ 单丽伟，冯贵颖，范三红.产甲烷菌研究进展［J］.微生物学杂志，2003，23(6):42－46.

［11］ Lutan P E，Wayne J M，Sharp R J，et al. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill［J］. Microbiology，2002，148:3521－3530.

［12］ Springer E，Sachs M，Woese C R，et al. Partial gene sequenees for the a subunit of methyl-coenzyme M reduetase (MCR I)as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae［J］. Int J Syst Bacteriol，1995，45:554－559.

［13］ Luton P E，Wayne J M，Sharp R J，et al. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill［J］. Microbiology，2002，148:3521－3530.