周学亮，万 力，刘季春

（南昌大学第一附属医院心脏外科，江西南昌330006）

Notch信号通路于90年前经摩根首次发现，其特点为该通路的受体Notch活性受糖基化、胞内运输差异和泛素化降解调控，而不依赖于第二信使的放大［1］。在多种生物的心脏发育期，Notch信号参与了心肌细胞分化、房室沟分界、瓣膜发育、流出道重塑、心室小梁形成等诸多过程［2-4］；心脏发育成熟后，Notch的作用可控制心血管系统对缺血缺氧损伤的反应，抑制心肌细胞纤维化，增强受损后心肌细胞活力［5-7］。本研究拟采用微小干扰核糖核酸（miRNA）技术，通过设计针对大鼠Notch1基因干扰序列，构建能在真核细胞中表达miRNA序列的载体，并转染H9c2心肌细胞，筛选干扰大鼠Notch1基因最佳的miRNA，为进一步观察Notch信号通路在心肌细胞的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株 H9c2心肌样细胞购自中科院上海生命科学院细胞库，Top10化学感受态细胞购自Invitrogen公司。

1.1.2 干扰质粒 BLOCK-iTTMPolⅡ miR RNAi Expres-sion Vector Kits购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要试剂 T4DNA Ligase购自TaKaRa公司，质粒小提试剂盒购自OMEGA公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，兔Cleaved Notch1单克隆抗体购自abcam公司，小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥公司，化学发光试剂盒（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 干扰片段设计与合成 针对GeneBank中的大鼠Notchl基因编码序列（NCBI Reference Sequence：NM＿001105721.1），在Invitrogen网站分别在线设计3对pre-miRNA序列（表1），交Invitrogen公司合成，规格为2OD。

1.2.2 靶向Notch1miRNA干扰质粒的构建 将3对Oligonucleotide各自用TE Buffer溶解成200μmol／L，互补单链经退火形成……