曾鹏,王一冰,刘华林

(1 青岛大学医学院儿科学教研室,山东青岛 266071; 2 青岛市妇女儿童医院血液肾脏科)

CTLA-4基因CT60位点基因多态性与小儿急性淋巴细胞白血病相关性

曾鹏1,王一冰1,刘华林2

(1 青岛大学医学院儿科学教研室,山东青岛 266071; 2 青岛市妇女儿童医院血液肾脏科)

目的探讨CTLA-4基因CT60位点多态性与小儿B系急性淋巴细胞白血病(ALL)的关系。方法选取86例B系ALL病儿和112例正常对照者,分别留取外周血标本,提取基因组DNA,聚合酶链式反应及产物直接测序方法检测CT60位点基因型,比较两组以及病例组不同性别、不同临床危险度病儿基因型频率及等位基因频率的差异。结果病例组CT60位点AA和AG基因型频率显著低于对照组(χ2＝6.365,P＜0.05),A等位基因频率亦明显低于对照组(χ2＝6.761,P＜0.05);CT60位点基因型及等位基因频率分布与B系ALL病儿性别及临床危险度无关(P＞0.05)。结论CTLA-4基因CT60位点基因多态性与小儿B系ALL易感性存在相关性。

白血病,淋巴细胞,急性;基因,CTLA-4;多态性,单核苷酸

急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最常见的肿瘤,发病率约(3～4)/10万,其病因及发病机制目前尚不明了,一般认为多因素参与致病,其中免疫监视功能异常可能是因素之一。CTLA-4是T细胞活化中一种重要的负性调节蛋白,可以通过降低T细胞活化抑制人体抗肿瘤免疫反应。本文通过研究CTLA-4基因CT60位点多态性与儿童B系ALL的相关性,探讨儿童ALL遗传易感性,了解其免疫学发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年3－9月,选取青岛市妇女儿童医院及青岛大学医学院附属医院血液儿科收治86例B系ALL病儿作为病例组,男54例,女47例,年龄1～14岁,平均年龄(5.60±3.02)岁;标危型54例,高危型32例。对照组112例为青岛市妇女儿童医院儿童保健科健康体检儿童,男50例,女62例,年龄1～14岁,平均年龄(6.30±2.76)岁,排除其他肿瘤性疾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病,近半年无重大感染性疾病,无糖皮质激素等免疫抑制剂用药史。全部研究对象均无血缘关系。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 采集空腹静脉血2 m L,EDTA抗凝,使用提取试剂盒(中国天根公司生产)提取DNA,用k5500微量分光光度计测DNA的吸光度(A)值及浓度,A值介于1.8～2.0之间说明纯度较高,符合标准,调整DNA浓度至10～100 mg/L,于－20℃保存。

1.2.2 聚合酶链式反应(PCR) 参考已发表文献的CTLA-4基因核酸序列(Gene ID:1493),委托上海Majorbio公司设计并合成引物。上游引物F:5′-GCTTCATGAGTCAGCTTTGC-3′,下游引物R: 5′-CTGTGTTAAACAGCATGCCA-3′。超纯水溶解引物,使其终浓度为5μmol/L。PCR反应体系: Premix Ex Taq(大连TAKARA公司生产)25μL,上下游引物各2μL,DNA 7.5μL,使用超纯水补足50μL。反应条件:95℃预变性5 min;98℃变性5 s,62℃退火30 s,72℃延伸10 s,共35个循环; 72℃后延伸10 min。

1.2.3 PCR产物鉴定和测序 取产物5μL加上样缓冲液1μL,于20 g/L琼脂糖凝胶电泳中检测PCR产物,在凝胶成像仪下观察结果并摄影,取电泳条带较亮者委托上海Majorbio公司采取Sanger法常规测序。将测序所得核酸序列与BLAST比对,用ChromasPro软件分析测序结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行处理。直接计数法计算基因型和等位基因频率,Hardy-Weinberg平衡检验及组间比较采用χ2检验。以AA基因型或A等位基因为暴露因素,采用比数比(OR)及95%可信区间(95%CI)评价疾病与基因的关联强度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 遗传平衡

经χ2检验,对照组符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。

2.2 CTLA-4基因CT60位点基因型判定

PCR扩增产物长为161 bp,测序得3种基因型,分别为AA、AG和GG。见图1～4。

2.3 两组CTLA-4基因CT60位点基因型及等位基因频率分布

CTLA-4基因CT60位点基因型及等位基因频率在两组的分布差异均有统计学意义(χ2＝6.365、6.761,P＜0.05)。与对照组相比,病例组AA和AG基因型明显减少,而GG基因型比例增加。以AA基因型为基准,AG和GG基因型的OR值分别为1.176和2.590。病例组携带G等位基因明显增多,以A等位基因频率为基准,G等位基因的OR值为2.066。见表1。

2.4 病例组不同性别之间CTLA-4基因CT60位点基因型及等位基因频率分布

与女性病儿相比较,男性病儿CTLA-4基因CT60位点AA和GG基因型减少,A等位基因频率降低,但差异无显著意义(P＞0.05)。因例数太少,故将AA和AG基因型合并分析。以AA＋AG基因型的总和为基准,GG基因型的OR值为1.898;以A等位基因频率为基准,G等位基因的OR值为1.537,差异均无显著意义(P＞0.05)。见表2。

2.5 病例组不同临床危险度之间CTLA-4基因CT60位点基因型及等位基因频率分布

与低危病儿相比较,高危病儿CTLA-4基因CT60位点AA和GG基因型增多,A等位基因频率升高,但差异无显著性(P＞0.05)。因例数太少,亦将AA和AG基因型合并分析。以AA＋AG基因型的总和为基准,GG基因型的OR值为0.485;以A等位基因频率为基准,G等位基因的OR值为0.452,差异均无显著性(P＞0.05)。见表3。

3 讨 论

急性白血病是高度异质性的造血组织的恶性疾病,其病因尚未完全明了,可能与病毒因素、理化因素及遗传易感性相关。近年来,对免疫相关遗传机制的研究,尤其是免疫调节相关基因的研究有可能揭示自身免疫性疾病及肿瘤发生发展的机制。免疫调节相关基因的多态性可能影响个体之间免疫应答反应以及疾病易感性的不同。如IL-18、IL-10、TGF基因多态性分别与原发性干燥综合征、胃窦癌及结直肠癌患病风险相关[1-3]。

CTLA-4基因是免疫调节相关基因之一。该基因表达于活化的T细胞表面,可与相应配体结合后传递负性反馈信号发挥免疫调节作用。CTLA-4在T细胞应答的不同阶段都发挥了重要作用,包括调节T细胞活化阈值,抑制T细胞增殖和诱导活化T细胞凋亡[4]。与同源的CD28分子不同,CTLA-4能够传递抑制性信号,抑制T细胞的活化增殖,抑制免疫反应,有可能诱导外周免疫耐受。由此可以推断,阻断CTLA-4可以增强免疫应答,已有动物实验报道其与肿瘤疫苗联用可以治愈荷瘤小鼠[5]。CTLA-4已经被视为抑制抗肿瘤免疫的重要调节因子。CTLA-4的基因多态性可影响其表达水平,由此可以推测,其基因多态性可能影响着肿瘤的发生发展。相关研究已经报道了一些CTLA-4的多态性位点,其中的＋49A/G、－318C/T、－1661A/G、－1722T/C等多态性位点,分别与胰腺癌、胃癌、结直肠癌、乳癌等疾病相关[6-9]。

CT60位点是最近发现的一个多态性位点,李恒等[9]的研究结果显示,中国北方汉族女性乳癌病人CT60位点G等位基因频率明显高于正常对照组。本研究探讨了CT60位点与中国儿童B系ALL的关联性,病儿GG基因型和G等位基因频率较对照组明显升高,而这种差异同性别及临床危险度无关。这与李恒等[9]的研究一致,提示CTLA-4基因有可能是人类多种肿瘤的共同易感基因之一。与在中国人群中的研究结果不一致。COZAR等[10]的研究显示,西班牙人群中肾细胞癌病人CT60位点的AA基因型频率较高,但在结肠癌中并没有明显的相关性。在不同人种的不同肿瘤性疾病中该多态性位点可能发挥着不同的作用,具体机制尚不明确。UEDA等[11]研究显示,CT60位点G等位基因与可溶性CTLA-4(sCTLA-4)表达减少相关,CT60位点决定了剪接作用的效率及sCTLA-4的m RNA产量,从而决定了sCTLA-4相对于全长CTLA-4的量,尤其是纯合子中GG基因型个体相对于AA基因型个体,sCTLA-4产量降低。本文中病儿CT60位点G等位基因频率较对照组明显升高,由此推测病儿sCTLA-4水平可能下降。未激活的T细胞常规产生sCTLA-4,而活化后产量降低。通常认为膜表面蛋白的可溶形式与其竞争性结合配体而发挥抑制作用[12]。sCTLA-4的水平降低,相对加强了B7-mCTLA4的相互作用,诱导了T细胞无能,从而抑制了T细胞活化。可以进一步研究病儿外周sCTLA-4的表达,从而阐明免疫机制在小儿白血病发病中的作用。

总之,本研究表明,CTLA-4基因CT60位点基因多态性与中国小儿B系ALL存在一定相关性,但此位点的具体作用机制是否是通过影响sCTLA-4的表达而发挥作用需要进一步的研究。此外,易普利姆玛(Ipilimumab),一种阻断CTLA-4的单克隆抗体,已被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤,此药能否作为一种靶向治疗药物用于难治性白血病需要进一步的探讨。

[1]李恩泽,辛苗苗,胡彬,等.IL-18基因多态性与原发性干燥综合征的相关性[J].青岛大学医学院学报,2010,46(4):333-338.

[2]孙风波,张佃良,郑红梅,等.血清IL-10水平及其基因－1082A/G位点单核苷酸多态性与胃窦癌恶病质的关系[J].齐鲁医学杂志,2010,25(3):189-194.

[3]FORSTI A,LI X,WAGNER K,et al.Polymorphisms in the transforming growth factor beta 1 pathway in relation to colorectal cancer progression[J].Genes Chromosomes Cancer, 2010,49(3):270-281.

[4]王彦波,吕明,张淑杰,等.CTLA-4及其单克隆抗体功能及应用研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23(6):587-590.

[5]HURWITZ A A,FOSTER B A,KWON E D,et al.Combination immunotherapy of primary prostate cancer in a transgenic mouse model using CTLA-4 blockade[J].Cancer Res, 2000,60:2444-2448.

[6]LANG C C,CHEN L,LI S L.Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4＋49G/A polymorphism and susceptibility to pancreatic cancer[J].DNA Cell Biology,2012,31(5):683-687.

[7]宋继权,夏冰,李睿,等.胃癌与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4基因启动子区域多态性的相关性研究[J].中华实验外科杂志,2006,23(11):1373-1374.

[8]HADINIA A,HOSSIENI S V,ERFANI N,et al.CTLA-4 gene promoter and exon 1 polymorphisms in Iranian patients with gastric and colorectal cancers[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2007,22(12):2283-2287.

[9]李恒,傅振坤,王丽虹,等.细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(3):282-284.

[10]COZAR J M,ROMERO J M,APTSIAURI N,et al.High incidence of CTLA-4 AA(CT60)polymorphism in renal cell cancer[J].Hum Immunol,2007,68(8):698-704.

[11]UEDA H,HOWSON J M,ESPOSITO L,et al.Association of the T cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease[J].Nature,2003,423:506-511.

[12]PRUOHIT S,PODOLSKY R,COLLINS C,et al.Lack of correlation between the levels of soluble cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4(CTLA-4)and the CT-60 genotypes [J].Journal of Autoimmune Diseases,2005,2:8.

(本文编辑 马伟平)

ASSOCIATION OF CYTOTOXIC T LYMPHOCYTE ANTIGEN-4 CT60 GENE POLYMORPHISM WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA IN CHILDREN

ZENG Peng,WANG Yibing,LIU Hualin (Major of Pediatrics,Qingdao University Medical College,Qingdao 266071,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen-4(CTLA-4)CT60 gene polymorphism and children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).MethodsA total of 86 children with ALL and 112 healthy controls was selected.Their genomic DNA was extracted from peripheral blood samples.The genotype was determined by polymerase chain reaction(PCR)and PCR product sequencing.Genotype and alleles frequency were compared between the two groups.ResultsThe frequency of AA and AG genotype was significantly lower in the patients than the controls(χ2＝6.365, P＜0.05),and so did A allele gene(χ2＝6.761,P＜0.05).This kind of difference was not associated with sex and clinical risk.ConclusionCTLA-4 CT60 gene polymorphism is associated with susceptibility to ALL in children.

leukemia,lymphocytic,acute;genes,CTLA-4;polymorphism,single nucleotide

R725.5

A

1008-0341(2013)04-0310-04

10.11712/qlyx201304010

2013-01-23;

2013-05-10

曾鹏(1987-),女,在读硕士研究生。

刘华林(1958-),女,主任医师,硕士生导师。