连腾祥，王光华，于镇华，刘居东，金 剑，刘晓冰

(1. 中国科学院东北地理与农业生态研究所中国科学院黑土区农业生态重点实验室，黑龙江哈尔滨150081;2. 中国科学院大学，北京100049)

0 引 言

碳(C)元素是组成生命物质的主要成分之一［1］。大气中的CO2是植物碳的主要来源，光合作用将大气CO2合成为植物有机碳，并固定在植物体内，部分固定的有机碳向土壤释放，在土壤微生物作用下发生进一步的转化［2］。研究表明，每年约十分之一的大气CO2通过植被进入土壤［3］。因此，碳的固定是生物在地球上生存的一个基础［2］。土壤微生物可以利用植物释放的光合碳并将其中的一部分转化为土壤有机碳，是土壤有机质和土壤养分转化和循环的动力［4－6］，在土壤有机碳转化和稳定土壤碳库方面起着非常关键的作用［7］。因此，解析根际微生态系统中碳转化以及利用光合碳的微生物种类对于有效提高作物生产力、促进农业发展具有非常重要的意义。近期发展起来的稳定性同位素探测技术(stable isotope probing，SIP )可以确定参与碳转化的微生物群落结构和功能，以及复杂群落中微生物的相互关系，比传统实验室培养微生物方法有更大优势和发展空间［8－11］。简要概述了国内外光合碳转化的相关动态，讨论了土壤微生物在光合碳转化过程中的重要性，重点综述了SIP 技术及其分析原位微生物的代谢功能以及多样性的进展和问题。

1 光合碳在植物地下部的分配

光合碳是“大气－植物－土壤”系统碳循环的重要组成部分。大气圈、土壤圈和生物圈三者之间的元素循环使该系统形成了动态有机体。植物的光合作用和土壤的呼吸作用是这种动态有机链的基本代谢过程，二者共同驱动碳的生物地球化学循环过程［12］。通过光合作用形成的有机化合物约占植物干质量的90%，而碳是构成有机化合物的主要骨架［12］。光合碳经过植物的韧皮部转运到地下，一部分用于根系生长，一部分以根系沉积物的形式输入根际土壤环境中［13］，并被土壤微生物作用后部分以CO2和CH4等气体的形式返回大气中，或以有机质形式贮存于土壤中［12］。这样就形成了大气－植被－土壤－大气整个陆地生态系统的碳循环［1］。

光合碳向地下部分配的比例因植物光合途径的不同而存在差异。研究表明，小麦(C3植物)生育期内，约有30%～60%光合碳转运到地下部分［14］。亚热带地区的水稻(C3植物)净同化碳分配到根部和土壤中的比例分别约为10%和5%［15］。然而，玉米(C4植物)光合碳只有0.5%～10%被转运到土壤中［16］。

光合碳在地下部的分配也因生育时期不同而发生较大的变化。何敏毅等［17］报道了玉米的苗期、拔节、抽雄和灌浆期，向地下转移的13C 比例分别为43.2%、46.5%、30.3%和20.0%。Swinnen 等［18］研究表明小麦成熟期向地下分配的碳量少于生长前期，拔节期向地下部分配30%～40%的光合碳，而成熟期仅有5%～20%［19］。Jin 等［20］用13CO2标记大豆，发现大豆分配到地下部分的光合碳在苗期和鼓粒期分别为18.4%和3.5%。

2 土壤微生物和光合碳之间的相互作用

在植株生长期间，光合碳以根系分泌物及脱落物的形式向土壤释放，在根际微生物群落演替以及种群格局变化上起到重要的作用。早期人们主要集中在碳水化合物和氨基酸上的研究，并发现这些物质不仅为根际微生物提供大量的碳源与氮源，也影响着根际微生物的多样性［21］。研究表明，30%～40%的土壤有机质来自根系分泌物和死亡的根［22］。根系分泌物中的碳将植物根系、土壤和微生物连为一体，是根际微生态系统正常运行的基本动力。同时微生物也刺激了根系分泌物的释放，这必然会影响到植物－土壤－微生物之间碳的平衡［13，23］。Chaboud 等［24］研究指出，玉米不同生育期的土壤微生物分布明显不同，是因为根系分泌物中蛋白质与总糖含量在不同时期差异明显。Xu 等［25］研究指出，生育时期的变化是影响大豆根际土壤细菌和真菌群落结构变化的重要因素。

土壤微生物也是推动碳在土壤－大气循环过程中的重要组成成分［26］。例如，微生物剌激一些植物激素的产生提高了细胞膜通透性［27］。一些细菌产生的柠檬酸可以促进菌根的生长［28］;菌根增强植物的光合速率［29］;以及微生物对根的机械损伤作用［27］。这些因素都可利于根系分泌物的释放，从而影响碳在整个根际微生态系统中的平衡。因而，了解和探究与碳转化相关的微生物特征，尤其是利用光合碳的微生物群落结构变化，对于系统揭示农田生态系统碳循环过程响应的微生物机制有重要意义。

3 稳定性同位素探针技术(SIP)及其发展

如何将某种特定微生物和它们的功能联系到一起，是鉴定碳转化相关微生物特征的关键问题。以前人们解决上述问题都是在确定某种微生物的生理、生化和遗传水平之后，在实验室内单独培养。这样，代谢特性和细胞间的相互作用可用于推断微生物和与其亲缘关系较近的微生物在自然环境中可能存在的功能。然而，这些微生物只代表广泛分布于环境中的一小部分［8］，因此，培养方法丢失了大量有关微生物功能的信息。虽然近几十年来梯度凝胶电泳(PCR－DGGE/TGGE)和荧光原位杂交(FISH)等分子生物学技术不断的应用于微生物生态学中，大大提高了人们对微生物遗传多样性的认识，但得到的结果仍不足以提供相关微生物间的相互作用及其代谢功能的直接信息［30］。

近期发展起来的稳定性同位素探测技术(SIP)是连接某种特定微生物和它们功能的一种功能强大的新方法［9－10］。这种方法也被用来追踪根际环境中利用光合碳的活跃微生物［11］。其原理是基于自然界中13C的比例约占1%，当用13C 标记的底物来培养微生物时，通过微生物的代谢合成使得13C 进入磷脂脂肪酸(PLFA)以及核酸(RNA 或DNA)中，被标记物质的分子量随之增加，通过GC、GC/MS 或GC/C/IRMS测定PFLA 中13C 的相对丰度，进而观察13C 在微生物中的分配情况，确定功能微生物类群［30－31］。DNA 和RNA－SIP 则需以CsCl (或三氟乙酸铯，CsTFA)为介质对核酸进行超高速密度梯度离心，将核酸中标记13C 和未标记组分区分开，较重的磷脂脂肪酸或核酸分子所代表的即为代谢活跃的微生物类群［32］。

3.1 PLFA－SIP

在SIP 实验中，最早使用的特异性生物标志物是PLFA［33］。一般来说，只要有少量的13C 被同化到PLFA 中，就足够使研究者进行实验分析。Bahn 等人［34］利用PLFA－SIP 研究在间断供给13CO2的情况下，高山草原地下部13C 的分配并没有受到影响，但碳源强度却影响到土壤微生物对近期光合碳的利用和转化，并验证了光合碳可以迅速分配到根系和微生物群落当中。Lu 等［35］利用PLFA－SIP 的方法检测了水稻根际中利用近期光合碳活性微生物的空间变异，结果显示活性微生物在水稻根系存在水平和垂直的变化，同时发现吸收利用近期光合碳的微生物主要是革兰氏阳性菌以及真核微生物。

虽然PLFA－SIP 的灵敏度高，但是由于某些PLFA 并不具有特异性，不同的微生物种类可能会有某一种或几种类似的磷脂脂肪酸组成，很难判断检测出的磷脂脂肪酸代表哪种的微生物类群［36］。所以这种方法暂时还不能为转化光合碳的微生物提供系统发生学信息。

3.2 DNA－SIP

同PLFA 相比，基于核酸(DNA 或RNA)的SIP 可以为我们提供大量有关微生物遗传多样性和分子生态学方面的信息［37］。

DNA－SIP 的理论基础并不是最近才发现的，早在1958 年，Meselson 和Stahl［38］就预言，当DNA 的分子被标记导致密度增加时，DNA 在复制过程中亲代和子代之间分子分配的问题就可能会被解决。他们不仅证明了大肠杆菌可以生长在标有15N 和14N 的稳定性同位素氮源(NH4Cl)上，而且也引入了氯化铯(CsCl)密度梯度离心技术。核苷酸中含有大量的碳和氢，也可以被较重的稳定性同位素13C 和2H 标记［39］。尽管DNA 的浮力密度随鸟嘌呤－胞嘧啶(G+C)的含量不同而有着较大变化［40］，但是由于自然界中存在的稳定性同位素比例非常低，利用高丰度13C 同位素为底物还是会使标记和未标记的DNA 产生较大的差异。

DNA－SIP 最重要的特征是:经等密度梯度离心分层后收集到较重的DNA (13C－DNA)，包含微生物种群的基因组。因此，用聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌、古细菌和真核生物的SSU (核糖体小亚基)rRNA 基因是鉴定它们不可或缺的基础。可以根据已知可培养微生物的代谢功能设计出相应的引物进行PCR 扩增［41］。Radajewski 等［9］在这些原理的基础上首次阐述了DNA－SIP 的应用。

虽然以13CH3OH、13CH4或13CO2(99%13C 的碳原子含量)为基质的DNA－SIP 研究多集中在甲烷氧化过程［42－43］或是氨氧化上［44］，但近期有关碳转化微生物群落结构变化的研究越来越多。Ostle 等［45］在草地上标记了13CO2，结合DNA－SIP 发现释放到土壤中的13C 在5 h～48 h 后出现第一个高峰，并且在136 h 后出现次高峰。Bernard 等［46］用DNA－SIP 技术对水稻根尖进行研究，发现ɑ 和γ 变形菌、鞘氨醇杆菌和灰色链霉菌可能是水稻根尖细胞的主要降解菌，并且这些细菌与培养在愈伤组织上的细菌不同。Lee 等［47］用葡萄糖－13C 培养的水稻根尖细胞，利用DNA－SIP 技术鉴定分解根尖细胞的细菌，结果表明70%以上是革兰氏阴性菌，而在水分较少的愈伤组织上培养的分解者只有38%的细菌为革兰氏阴性菌。

被标记的微生物DNA 所需要的底物，以及被标记的时间是DNA－SIP 研究的限制源。在提取DNA前，长时间的标记(大于40 d)已在少量土壤样品(小于10 g)中应用，并且可以在CsCl 梯度中检测到被标记的DNA［9］。当标记底物在体积较大(200 ml)的条件下标记时，仅需要较短的同化时间(5 d)［44］。但以上两种标记都会产生中间代谢产物，而这些物质又可以被非目标微生物所利用(交互饲喂)。交互饲喂的效果可能会对DNA－SIP 实验造成一系列持续的影响和改变。另外，即使在高度活跃的生物反应系统中，DNA 的周转率也相对较低，得到足够被标记的DNA 相对比较困难［48］。所以，还需要找到更加灵敏的方法来鉴定有关碳转化微生物的群落特征［9］。

3.3 RNA－SIP

与DNA－SIP 技术相似，以RNA 为基础的稳定同位素探测技术(RNA－SIP)同样也适用于研究特定的微生物种类和功能［41］。Manefield 等［49］认为在SIP 实验中，RNA 是一种比DNA 更加敏感的生物标记物，这是因为在活跃的细胞中，RNA 的合成速率更高，而且在不需要合成或复制DNA 的情况下也可以进行标记。从序列分辨率的角度来看，微生物所提供的SSU (核糖体小亚基)rRNA 基因，可以使我们在不知道任何相关信息的情况下，辨别出微生物的生物化学过程［41］。Lu［50］等已经证明RNA－SIP 可以适用于识别植物－土壤系统中利用根际碳的活跃微生物，并认为水稻根际环境中，吸收利用光合碳的微生物是ɑ 和β变型菌门。Drigo 等［51］将莎草置于13CO2的环境中，并利用RNA－SIP 技术发现丛枝菌根真菌(AMF)是碳在植物和土壤之间运移的重要参与者。

RNA－SIP 和DNA－SIP 之间最根本的不同是，RNA 依赖目标微生物的转录组(transcriptome)。因此，RNA－SIP 一个主要优势是细胞里rRNA 的自然扩增。此外，在一定浓度数量的样品中，RNA 的标定速率远高于DNA 的标定速率［48］。这就表明，RNA－SIP 可能比DNA－SIP 更加敏锐，因此这种方法在更少底物和更短标记时间的情况下就可以达到我们需要的结果。

RNA－SIP 中还需要考虑到一系列重要的因素，如RNA 比DNA 有着较高的浮力密度，被评测的几个浮力密度梯度表明，用铯三氟乙酸乙酯(CsTFA)来代替CsCl 作为离心介质可以取得更好的效果［48］。由于RNA 可以吸收UV 光，因此直接观察RNA 是不合理的。所以大多数的研究是用蠕动泵和注射器一起分层含有RNA 的梯度(最多20 层)。琼脂糖凝胶电泳结果显示，几乎所有的目标RNA 都集中在3 个或4 个浮力密度梯度中。然而，RT－PCR (反转录RCR)扩增检测到的RNA 横跨整个浮力密度梯度。所以解决这一问题的关键是对每一层浮力密度梯度进行RT－PCR 和变性梯度凝胶电泳分析，并且观察标记带的强度变化［49］。

4 SIP 存在的问题与展望

DNA－SIP 和RNA－SIP 的应用仍处于起步阶段，仍然有许多技术方面的问题没有得到充分的解决。追踪一个特定的生物化学过程是否能用SIP 技术，主要考虑的因素是看目标有机体的核酸是否能标记上足够的13C 标记的原子，以达到可以收集到足够13C 核酸的程度［44，49］。一系列的实验研究表明，RNA 被标记的13C 至少要达到20%，才可以和12C 区分开来，以达到鉴别微生物并发掘与其代谢功能之间的联系［52］。同时，这一数值要比以前评估DNA－SIP 中的数值要低［9］。微生物DNA (12C)G +C 比例范围为35%～70%，其对应的浮力密度范围大概为1.69 g·cm－3～1.73 g·cm－3［40］。然而，含有100%13C 的相同DNA，其浮力密度大概为1.75 g·cm－3～1.79 g·cm－3。所以，当提取环境样品时，最好能使其核酸13C 含量大于50%，以避免12C－DNA 中可能会存在过高的G+C 含量，进入13C－DNA 的组分，影响实验结果［41］。

目前，浓度较高(如10%CH4或500 μg·ml－1苯酚)且大量的标记底物已被用于标记核酸。然而，尽管是在像土壤这样的复杂环境内，SIP 也很容易受到微生物富集的影响［9，44］。研究表明标记最重部分的13C－DNA 包含目标微生物的序列，也可能包括有着紧密营养关系的微生物。SSU (核糖体小亚基)rRNA 是链接微生物功能和类别较好的生物标志物候选，但RNA－SIP 在自然样品中的应用存在限制，这可能是因为碳稳定性同位素的测定需要大量的RNA (10 μg～100 μg)［52］，提高13C 含量的一种方法要基于细胞本身对rRNA 的捕获能力，然而许多生物合成及分解途径导致了离心后其它同位素的分层，这些分层很可能会比RNA 分层更为严重［41］。

随着SIP 技术的不断发展和成熟，其应用领域也从先前的甲烷氧化菌中的应用拓展到根际微生物生态学和环境微生物生态学等领域中，并为我们提供了许多关于微生物遗传多样性的信息［53］。

SIP 技术除了与上述的梯度凝胶电泳(PCR－DGGE/TGGE)等技术相结合外，其DNA－SIP、RNA－SIP 以及PLFA－SIP 三者之间也可以相互结合，弥补各自的缺陷与不足。如Drigo 等［51］利用RNA－SIP 和PLFA－SIP 技术的结合，以莎草为研究对象，示踪影响土壤微生物的光合碳，提出升高大气中CO2浓度可以增加植物吸收C 的效率，从而影响植物的生理动态。植物固定的C 可以加快植物根部C 周转，增强C向土壤中转移速率以及表皮细胞、植物组织脱落程度和增加根系分泌物释放。Pratscher 等［54］利用RNA－SIP 和DNA－SIP 研究了土壤氨氧化古细菌和细菌的活性，阐述了氨氧化和CO2同化的高度耦合，并证明了土壤中氨氧化古菌固定CO2的机制是3－羟基－4－羟基丁酸酯循环。

此外，该技术还可以与高通量测序技术相结合，有助于人们进一步认识参与土壤植物体系碳循环的特定微生物，并通过研究其基因，阐明其作用机制，从而为今后有效控制土壤作物体系中有机碳利用与周转等提供新的思路与方法。

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