叶劲松

合肥学院生物与环境工程系 合肥 230601

环境微生物学实验技术进展

叶劲松

合肥学院生物与环境工程系 合肥 230601

光学显微镜是环境微生物实验中进行显微观察所必不可少的基本仪器手段。简介光学显微镜的发展历程，重点介绍突破光学分辨率技术的最新光学显微镜研制进展；围绕显微镜实验教学技术模式，对于最新的数码显微互动系统和对可替代部分真实显微镜的虚拟仿真显微镜系统进行简介及展望。

环境微生物学；实验技术；光学显微镜

10.3969/j.issn.1671-489X. 2013.18.128

作者：叶劲松，实验师，研究方向为环境微生物学。

环境微生物学是建立在实验基础上的操作性很强的一门学科。在环境微生物学实验中经常使用的仪器为光学显微镜和高压灭菌锅。其中，光学显微镜是进行显微观察所最不可少的基本仪器和手段，对于光学显微镜尤其是突破其光学分辨率上限的研究一直是热点。另外，随着计算机技术发展，以显微镜为主要工具手段的实验教学模式技术也在不断变革之中，新的教学模式技术直接推动了显微镜实验教学效果的增强。相对于显微镜来说，高压灭菌锅除了从手动升级为自动之外，其它并无大的变化。故本文主要从光学显微镜发展及其教学模式技术革新的视角，对环境微生物实验技术展开综述。

1 光学显微镜的发展

1.1 光学显微镜的研发历程

自光学显微镜发明以来，它的每一步发展都直接推动人类对微观世界的进一步认识。1590年左右，荷兰眼镜商Janssen父子发明了原始的光学显微镜（不超过10倍）。1665年，Robert Hooke用其制造的初具现代光学显微镜雏形的显微镜，第一次观测到软木塞中的“cella”（细胞壁，放大40～140倍）；1680年，荷兰人Anton van Leeuwenhoek用其制造的约300倍的显微镜第一次观察到细菌和原生动物[1]。

Leeuwenhoek去世后，显微镜研究进展缓慢。1752年，英国人J. Dollond发明消色差显微镜。1812年，苏格兰人D. Brewster发明油浸物镜，并改进了体视显微镜。1873年，德国物理学家Ernst Abbe[2]揭示了远场光学显微镜由于光存在衍射效应，预言了“阿贝极限”存在，即普通光学显微镜分辨力极限约为200 nm[3]。13年后的1886年，Abbe发明了复消差显微镜并改进了油浸物镜，至此，普通光学显微镜技术基本成熟。1904年后，又先后有荧光显微镜、干涉显微镜、相位差显微镜和Nomarski干涉相位差显微镜等特种光学显微镜问世[1]。

1984年，第一台商品化的共聚焦显微镜（型号为SOM-100）投入使用。多数共聚焦显微镜所用光源为激光，成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为激光扫描共聚焦显微镜。目前，德国LEICA公司的LEICA TCS SP2显微镜分辨率可达到180 nm。

1.2 突破光学分辨率极限的光学显微镜

自Abbe后的一个多世纪，200 nm的“阿贝极限”一直被认为是光学显微镜理论分辨力极限。此后提高光学分辨率工作一度停滞不前，小于这个尺寸的物体须借助电子显微镜或扫描隧道显微镜才能观察。

但是近年来提高分辨率有了较大进展，突破“阿贝极限”的光学显微镜相继问世。在20世纪80年代研发的近场光学显微镜（SNOM，Scanning Near-field Optical Microscope）的出现，是对于普通光学显微镜的首次革命。它不用光学透镜成像而是利用近场光学原理，借鉴扫描隧道显微镜（STM）扫描探针技术，在样品表面上方扫描获得表面信息[4]。1984年，瑞士IBM研究中心用金属镀膜的石英晶体尖端制成的纳米尺寸光孔作为探针，制成世界上第一台近场光学显微镜。同时，美国康乃尔大学用微毛细管拉成沟极细光孔为探针，制成近场光学显微镜。从此，近场光学显微镜广泛应用于各种微观观测领域[5]。目前的近场光学显微镜，所报道的分辨率已达λ/20～λ/40[6]。近场光学显微镜在纳米尺度光学观察上起到其他扫描探针显微镜和原子力显微镜所不能取代的作用[7]。

近场光学显微镜与传统光学显微镜的最大区别在于：以纳米级光学探针代替传统光学镜头；样品表面近场区域内存在携带表面精细结构信息的非辐射场，探针被控制于样品表面一个波长以内的近场区域内，可探测到亚微米级光学信息。这样就突破了“阿贝极限”的限制，理论上其分辨率是无限大的。NSOM的分辨率不依赖于光的波长，使其成为真正意义上的光学显微镜[8]。由于探针尖不能做得无限小和不能无限接近样品，实际分辨率是有限的[9]。近场光学显微镜能克服传统光学显微镜低分辨率以及扫描电子显微镜和扫描隧道显微镜对生物样品产生损伤等缺点，且能进行高分辨率光学成像，因此被广泛应用于生物样品的观察[10]。

1994年，德国人Stefan Hell巧妙地借助脉冲激光的作用，也突破了“阿贝极限”。他发明的新型光学显微镜STED（受激发射损耗），分辨率已达到50～70 nm，且理论上还能提高数倍（据称能够观察20 nm左右的微小生物）[11]。2011年3月1日，英国和新加坡研究人员报道他们制造出能够观测50 nm大小物体的光学显微镜，这是迄今观测能力最强的光学显微镜，也是世界上第一个能在普通白光照明下直接观测纳米级物体的光学显微镜。而且从理论上说，他们这种基于“透明微米球透镜”的光学显微镜不存在观测极限。

光学显微镜的世界品牌有奥林巴斯、尼康、蔡司和徕卡，这4家公司垄断了世界高端光学显微镜市场，各自拥有自己的独特技术。国产显微镜中，麦克奥迪是第一品牌，在国外也开始有了一定的知名度，它在显微数码互动方面也有较强的实力；永新光学是第二品牌，包括宁波永新与江南永新；其他品牌还有重庆光电、江西凤凰光学、桂林光学厂和浙江舜宇等。

2 显微镜实验教学模式技术的发展

2.1 传统显微镜实验教学模式的弊端

传统显微镜教学实验的方法：每个学生一台显微镜，教师也有一台显微镜；教师以自己的显微镜为教具，演示讲解显微镜如何使用，学生对照老师讲解操作自己的显微镜。部分学生在使用显微镜时总是找不到目标物像，易把琼脂等异物当作目标，这就需要教师不时走下讲台逐一调焦找目标。对于实验结果如何，教师不能逐一去验证。此教学模式导致上课秩序较乱，授课教师也疲于奔波，教学效果差。

2.2 数码显微互动系统的显微镜教学模式

近年来，数码显微互动系统的出现，是对传统显微镜教学方式具有革命意义的变革，它是伴随着计算机、通信和多媒体等技术的发展出现的。此系统由学生用数码显微镜、教师用多功能数码显微镜、软件平台、双向语音交流系统、图像处理分析系统、多媒体设备等组成[12]。学生显微镜内的数码信息传输到教师电脑上，教师可观察到每位学生正在观察的视野，继而通过投影仪把所有图像都投射到大屏幕上，可使每位学生在大屏幕上看到自己和其他学生所观察的图像。教师只需坐在讲台上，通过耳机和电子呼叫系统给学生做“一对一通话模式”或“一对多通话模式”讲授，实现良好的师生互动交流[13]，学生的学习兴趣被激发，教与学的效率也都明显提高。

国内知名显微镜厂商麦克奥迪、舜宇及山东易创等，都各自推出自己的显微互动系统，被许多院校用于形态学等实验教学[13-14]和普通微生物实验教学[15]。

2.3 虚拟仿真显微镜技术的教学模式

如果说数码显微互动系统还需要真实显微镜的话，那另外一种刚开始应用的、完全不需要显微镜的显微镜教学技术手段——显微镜虚拟仿真教学，则是对于显微镜实验教学模式的又一次革命，它是伴随计算机虚拟技术发展来的[16]。使用虚拟显微镜系统，不必购置昂贵的显微镜设备和易损耗的玻片，能让学生无任何危险地了解显微镜构造，又可以让学生不断地进行无损练习与反复操作显微镜，这有利于对显微镜实验过程的尽快认知与上手[16]。显微镜虚拟仿真教学促使从以教师为中心的授课形式变为以学生为中心的个性化教学，学生由被动听讲变为主动学习，实现了在没有教师参与情况下自己学习，极大地提高了学生的学习主动性。

目前从事显微镜虚拟仿真研发的公司还很少，它只在一定程度上替代显微镜操作而不能完全代替显微镜，毕竟实际动手操作的效果要强于任何媒体教学。不过作为一种新型的教学媒体，随着开发成本的降低，这种新的技术必将广泛应用于教学之中，发挥其特有的先前指导作用。

3 结语

光学显微镜一直在不断发展之中，它的每一进步都将直接推动微生物等微观研究领域学科的发展。随着计算机等行业的快速发展，以显微镜为工具的实验教学技术必将不断革新，实验教学效果也将得以不断优化、增强。

[1]王莉,蒋洪,孙丽丽.显微镜的发展综述[J].科技信息,2009(11):117-118,133.

[2]Ernst A. Contributions to the theory of the microscope and that microscopic perception[J].Arch. Microsc.Anat.,1973,9(1):413-468.

[3]毛峥乐,王琛,程亚.超分辨远场生物荧光成像:突破光学衍射极限[J].中国激光,2008,35(9):1283-1307.

[4]祝生祥.传统光学显微镜与近场光学显微镜[J].光学仪器,2000,22(6):34-41.

[5]姜凯.光学显微术的进展[J].山西大同大学学报:自然科学版,2009,25(1):66-68.

[6]朱星.纳米尺度的光学成像与纳米光谱:近场光学与近场光学显微镜的进展[J].物理,1996,25(8):458-465.

[7]朱星.近场光学显微镜[J].现代科学仪器,1998(1-2):84-89.

[8]胡明铅,蔡继业.扫描近场光学显微镜及其在单分子探测中的应用[J].化学进展,2008,20(6):984-988.

[9]田燕宁,陈烽,侯洵.近场光学显微术进展[J].光电子技术与信息,1999,12(6):1-7.

[10]李盛璞,蔡继业.扫描近场光学显微镜对细胞超微结构的研究[J].现代科学仪器,2010(2):169-172.

[11]徐娜.超越光学显微镜的极限:记2006年度“未来奖”得主施特芬·黑尔[J].世界科学,2007(2):44-45.

[12]王旭光,张忠,张玲,等.显微数码互动系统在病理实验教学中教学效果的分析[J].医学综述,2008,14(17):2717-2718.

[13]吴正升,王晓楠,王超群,等.组织微阵列结合显微数码互动教学系统在病理实验教学中应用[J].安徽医药,2010,14(10):1239-1240.

[14]闫晓华.数字网络显微互动教学系统在血液学检验实验教学中的应用[J].山东医学高等专科学校学报,2012,34(2):158-159.

[15]黄海婵,裘娟萍.基于显微数码互动系统的微生物形态实验教学改革与实践[J].微生物学通报,2013,40(3):517-521.

[16]马瑞,董玲燕,陈向东,等.基于三维仿真技术的显微镜生物实验教学系统[J].计算机技术与发展,2011,21(6):208-211.

Review of Experiment of Environmental Microbiology

Ye Jinsong

Optical microscopy is the essential and basic tool for microscopic observation in environmental microbiology experiments. The development history of the optical microscope, with focus on the latest progress of technology breakthrough of the optical resolution of optical microscopes was introduced. For illustration of the development of the teaching mode of experiments based on microscopes, the digital microscope mutual system and the latest microscope virtual simulation system that can partly replace real microscope functions were introduced and their applications were expected.

environmental microbiology; experiment; optical microscope

G642.423

B

1671-489X(2013)18-0128-03