王在峰 郭 蕊

1.菏泽家政职业学院，山东单县 274300；2.山东省单县中心医院，山东单县 274300

非霍奇金淋巴瘤（NHL）在我国的发病率较高，影响其预后的因素有很多，如年龄、全身状态、国际预后指数（IPI）、Ann-Arbor分期、ps评分等。近些年来研究发现，除了上述临床因素，仍有一些其他的因素影响NHL患者的预后。S激酶相关蛋白2（Skp2）和P27kip1蛋白在NHL组织中的表达逐渐引起国内外学者的关注。Skp2是细胞增殖周期中的一个重要因子，主导细胞周期从G1期进入S期的转化。 P27kip1是一种抑癌基因，对细胞增殖起负性调节作用，在肿瘤患者中其表达水平多异常。Skp2、P27kip1在NHL中的表达国内外均有相关报道，通过检测Skp2、P27kip1在NHL患者中的表达，分析其预后状况，可以指导患者的临床治疗。本文通过免疫组化法检测Skp2、P27kip1在NHL患者中的表达情况，并对42例NHL患者进行临床随访，获得了比较详细的临床资料，分析二者的相关性及对临床预后的影响，为判断患者的病情及预后提供新的参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究收集山东省单县正大医院2005年7月～2010年7月42例资料比较完善的NHL患者的临床资料，均经病理证实，有免疫组化病理标本，取材均为肿瘤组织，并于病理科收集患者石蜡标本。入组患者中，男26例，女16例，年龄27～71岁，中位年龄58岁；根据Ann-Arbor分期标准进行分期，Ⅰ期 20例，Ⅱ期 16例，Ⅲ～Ⅳ期 6例；IPI：0分14例，1分20例，≥2分8例；病理类型：B淋巴细胞型28例，T淋巴细胞型9例，其他5例。

1.2 治疗方法

全组NHL患者均采用化疗，化疗方案主要为CHOP方案（环磷酰胺、阿霉素或表阿霉素、长春新碱、激素），每21天为1个化疗周期，部分采用其他化疗方案 （COP、ECHOP或R-CHOP）。化疗期间患者主要出现恶心、呕吐、腹泻、纳差等消化道症状，贫血、白细胞、血小板下降等骨髓抑制反应，或伴有脱发，严重者可能出现多脏器功能损害，临床上给予对症处理，化疗后多数患者症状逐渐缓解。

1.3 检测方法

首先查阅42例NHL患者的原始病案登记资料，根据病理登记号及原始病理申请单，查找到患者最原始HE切片的记录结果，然后找到所需的石蜡块。用切片机进行蜡块切片，切片厚度为4 μm，连续切片4张，置于60°C烤箱1 h备用。实验操作按鼠Streptavidin-HRP免疫组化染色试剂盒说明书进行。鼠抗Skp2抗体工作液和鼠抗P27抗体工作液均购自北京中杉生物制剂有限公司，其他试剂购自华泽生物试剂有限公司。

1.4 染色判断标准

Skp2蛋白阳性为细胞浆内出现棕黄色颗粒；P27kip1蛋白阳性表达为细胞核内出现棕黄色颗粒。以试剂盒所带的阳性切片进行免疫组化染色，作为阳性对照；以生理盐水代替一抗行免疫组化染色，作为阴性对照。

1.5 随访

所有患者进行电话随访，随访截至2010年12月31日，随访中位时间为40个月。总生存时间是指从疾病确诊日期至患者死于任何疾病、最后随诊或截止观察日期。无病生存时间指治疗后达临床完全缓解（CR）之日至肿瘤复发进展、最后随诊或截止观察日期。截至最后随诊时间全组死亡15例。

1.6 统计学方法

全部数据采用SPSS 13.0软件包行生存分析，Kaplan-Meier法计算生存率，Cox模型进行单因素和多因素分析，计数资料Skp2、P27kip1蛋白阳性率比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman等级法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生存情况

全组死亡15例，3、5年生存率分别为 84.8%（33/42）、67.4%（25/42）；生存时间为10～112个月，中位生存时间为33个月，全组总生存曲线见图1。

2.2 Skp2与P27kip1蛋白表达情况

在高倍镜下Skp2与P27kip1的免疫组化阳性与阴性表达见图2。Skp2阴性组5年总生存率为86.00%（20/33），阳性组5年生存率为53.6%（5/9），差异无统计学意义 （P=0.061）。 P27kip1阳性组 5年总生存率为 88.9%（17/20），阴性组5年生存率为45.7%（8/22），差异有统计学意义 （P=0.001）。

2.3 Skp2、P27kip1在NHL中阳性表达的相关性

采用Spearman等级法分析结果显示，Skp2与P27kip1表达呈负性相关（r=-0.381，P=0.013）。

2.4 预后影响因素分析

对性别、年龄、全身症状、Ann-Arbor分期、IPI、ps评分、近期疗效、Skp2及P27kip1等临床因素进行单因素分析，结果显示，全身症状（P=0.045）、Ann-Arbor分期（P=0.009）、IPI（P=0.013）、ps 评分（P=0.037）、Skp2（P=0.044）与P27kip1（P=0.001）对NHL患者的总生存率有影响。利用COX比例风险模型，进一步行多因素分析显示，P27kip1、IPI、Ann-Arbor分期是影响NHL患者预后的独立因素（P=0.034）。

3 讨论

性的识别磷酸化底物，促使泛素-蛋白酶体途径降解，许多细胞周期中的调控因子、转录因子都是通过此种途径降解。Traub等[1]研究发现，Skp2的高表达与乳腺癌的发生、疾病进展及其临床预后等有密切相关性，其高表达促进了恶性肿瘤细胞的增生。国内陆建明等[2]对72例B-NHL患者研究发现，Skp2在侵袭性B-NHL组的表达高于惰性BNHL组。陈燕坪等[3]对60例弥漫大B细胞淋巴瘤中Skp2的表达研究结果示，Skp2的表达与弥漫大B细胞淋巴瘤的临床疗效密切相关，Skp2的表达越强，患者的疗效越差。从而表明弥漫大B细胞淋巴瘤组织中Skp2的表达，可作为指导临床治疗的参考指标，有助于改善疾病疗效和预后。陆晔等[4]报道，在NHL高危患者中，Skp2多呈现高表达，并指出Skp2高表达提示NHL患者的临床特征及预后较差。闵大六等[5]对96例弥漫大B细胞淋巴瘤患者的研究结果显示：Skp2蛋白的表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的Ann-Arbor分期、结外病灶数、全身症状、乳酸盐脱氢酶（LDH）水平有显著相关性，间接影响着患者的预后。但是本研究结果显示，Skp2表达与NHL预后无明显相关性，Skp2阴性组与阳性组患者5年生存率差异无统计学意义

Skp2在正常组织中表达较低或不表达，主要存在于肿瘤细胞周期的S期，其在调控细胞周期中起重要作用。Skp2作为干细胞因子（SCF）复合体的底物识别亚基，特异（P>0.05）。本研究认为，在NHL患者中Skp2的临床表达并不能指导患者的临床预后，但对其他恶性肿瘤的预后是否有影响尚待进一步研究。

P27kip1是一种抑癌基因，其负性调节细胞增殖，通过抑制细胞周期中各种蛋白和酶的活性，从而抑制细胞从G1期到S期的转化，致使细胞周期停滞，不能增殖。国外报道在膀胱癌及肝内胆管癌患者中P27kip1蛋白的表达与预后密切相关，P27kip1蛋白低表达组患者的存活率显著低于P27kip1蛋白高表达组，且P27kip1低表达的患者复发率更高，预后更差[6-10]。肖晖等[11]对NHL患者P27kip1蛋白的表达水平进行检测，并分析其影响因素发现，NHL组织分化程度干扰P27kip1蛋白的表达。Lu等[12]应用免疫组化技术监测92例NHL患者P27kip1表达，发现P27kip1表达水平越高，NHL的增殖活性越差，肿瘤侵袭性也随之下降，反之亦然。本研究中，P27kip1阳性组患者5年总生存率高于阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。P27kip1作为一种抑癌基因，其表达能抑制NHL组织细胞增殖，通过检查它在NHL患者癌组织中的表达强弱，能预测肿瘤患者预后。P27kip1的阳性表达能提高NHL患者的生存率。

大部分研究认为，Skp2与P27kip1表达呈负性相关，但对二者表达相关性的报道仍有争议。Katagiri等[13]研究发现，在肿瘤患者组织中Skp2蛋白的表达，造成P27kip1蛋白表达降低，从而导致细胞周期紊乱。Latres等[14]报道认为，Skp2与P27kip1蛋白表达呈负相关。但Lu等[12]研究报道认为，Skp2与P27kip1二者之间蛋白表达无明显相关性。本研究结果显示，在NHL患者中Skp2与P27kip1蛋白的表达呈负性相关（r=-0.381，P=0.013），可能在NHL中，Skp2蛋白通过泛素-蛋白酶体途径，使P27kip1蛋白合成途径中的一些调控因子、转录因子降解，从而使P27kip1在组织中的表达减弱。

综上所述，本研究通过免疫组化技术检测42例NHL患者组织中Skp2和P27kip1蛋白的表达，并对二者表达情况与临床资料及预后进行了统计学分析。研究结果表明，Skp2与P27kip1蛋白的表达在NHL中呈负性相关，P27kip1、IPI、Ann-Arbor分期是影响NHL预后的重要因素，可作为预测NHL临床疗效和判断预后的参考指标。

[1]Traub F，Mengel M，Luck HJ，et al.Prognostic impact of Skp2 and P27 in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2006，99（2）：185-191.

[2]陆建明，陆建新，沈爱国，等.Skp2和P27kip1蛋白在B型非霍奇金淋巴瘤中的表达、定位及意义[J].临床检验杂志，2008，26，（3）：167-169.

[3]陈燕坪，陈刚，郑天荣，等.弥漫大B细胞淋巴瘤中Skp2表达的临床意义[J].诊断病理学杂志，2008，15（6）：467-470.

[4]陆晔，潘相涛，程旭，等.非霍奇金淋巴瘤Skp2和P27kip1表达特点及其临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2010，15（10）：891-894.

[5]闵大六，李娟娟，欧玉荣，等.弥漫大B细胞淋巴瘤中Skp2和P27kip1表达及其临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2010，15（2）：145-148.

[6]Kim DH，Lee HI，Nam ES，et al.Reduced expression of the cell-cycle inhibitor P27kip1is associated with progression and lymph node metastasis of gastric carcinoma[J].Histopathoogy，2000，36（3）：245-251.

[7]Shin JY，Kim HS，Park J，et al.Mechanism for inactivation of the KIP familycyclin-dependentkinaseinhibitor genes in gastriccancer cells[J].Cancer Res，2000，60（2）：262-265.

[8]Wolowie D，Ciszak L，Kosmaczewska A，et al.Cell cycle regulation protein and apoptosis in B-cell chronic lymphocytic [J].Leukemia Haematologica，2001，86（12）：1296-1304.

[9]Lacoste CL，Gomez BA，Escourrou G，et al.Expression of P27kip1in bladder cancers：immunohistochemical study and prognostic value in a series of 95 cases[J].Cancer，2002，186（1）：115-120.

[10]Hashimoto N，Yachida S，Okano K，et al.Immunohistochemically detected expression of P27kip1and Skp2 predicts survival in patients with ihtrahepatic cholangio carcinomas[J].Ann Surg Oncol，2009，16（2）：395-403.

[11]肖晖，曾宪昌，张克俭，等.非霍奇金淋巴瘤P27kip1、P21WAF1及cyclinE 表达的意义[J].临床与实验病理学杂志，2006，16（2）：117-120.

[12]Lu JX，Zhang DM，Shen AG，et al.Expression and correlation of Skp2 and P27kip1in 92 cases of non-Hodgkim's lymphoma[J].Zhonghua Zhongliu Zazhi，2007，29（5）：373-377.

[13]Katagiri Y，Hozumi Y，Kondo S.Knockdown of Skp2 by siRNA inhibits melanoma cell growth in vitro and in vivo[J].Journal of Dermatological Science，2006，42（3）：215-224.

[14]Latres E，Chiarle R，Schulman BA，et al.Role of the F-box protein Skp2 in lymphomagenesis [J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：2515-2520.