张闽，董文宾，张小强

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021）

人体衰老和疲劳等过程都涉及自由基，制备高效的活性肽，开发新型食品添加剂，评价其清除自由基活性成为首选。明胶虽具有优良的物理性质[1-2]，可作为乳化剂等广泛应用于食品制造，每年用量达20 万t，占整个食品级明胶市场的60%以上。但由于其生物价（20）和氨基酸评分（0）比较低，虽然粗蛋白82 % 以上，但很少作为蛋白质来源生产活性肽，产品附加值很低。本研究以我国资源丰富的猪皮明胶作为原料，采用不同酶解方法，通过清除DPPH·的方式检测其抗氧化活性，期望为开发具有抗疲劳、抗衰老等功效的明胶活性肽提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

食品级明胶：山东淄博宝恩生物科技有限公司馈赠；胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶（Wolsen），木瓜蛋白酶：北京奥博星生物科技有限公司；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

835－50 型氨基酸自动分析仪：日本日立制作所；PHS-3C 型台式PH 计：上海精密科学仪器有限公司；HHS 型恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；JJ-1型精密增力电动搅拌器：上海浦东物理光学仪器厂；高速冷冻离心机：德国Heraeus 公司；Minimate TFF system 型超滤机：英国PALL 公司；722N 可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；其它为常规仪器。

1.3 方法

1.3.1 明胶蛋白含量和氨基酸组成的测定

明胶粗蛋白含量的测定参照国标GB/T5009.5-2010，应用微量凯氏定氮法；氨基酸组成分析用氨基酸分析仪测定。

1.3.2 明胶活性肽的酶法制备

参考相关文献[3-9]酶结构特点和pH 分类，用缓冲液在80 ℃溶解明胶，然后在酶最适活力下水解明胶，具体工艺如表1，水解完成后100 ℃加热25 min 灭酶，水解液用高速冷冻离心机离心、过滤，澄清后超滤机筛选分子量低于4 000 u 的上清液备用。不同酶解明胶工艺条件见表1。

1.3.3 明胶多肽对DPPH·的清除作用

自由基外围存在不成对电子，反应活性强，存在寿命短，化学性质很不稳定而难以检测，到目前为止除了H2O2其它自由基的测定仍没有合适方法。在评估抗氧化活性的方法中[10-11]，DPPH·具有在无水乙醇中化学性质稳定、半衰期长的特点，可通过计算清除率等参数反映抗氧化剂功效。加之该法在评价活性物功效时不受葡萄糖等杂质的干扰，重复性好，方法灵敏、操作简单，被广泛用于衡量样品的抗氧化能力。

表1 不同酶解明胶工艺条件Table 1 Enzymatic gelatin process conditions

具体实验步骤如下：用无水乙醇配置0.2 mmol/L的DPPH·溶液，先加待测液，再加无水乙醇，最后加DPPH 溶液，等混匀后在室温下暗室静置30 min，测517 nm 处吸收度，用下边的公式计算样品对DPPH·自由基的抑制率。抑制率K={1-（Ai-Aj）/Ac}×100%，式中：Ac为对照组；Ai为样品组；Aj为空白组。

1.3.4 明胶木瓜酶解多肽对DPPH·清除活性试验的优化设计

在单因素试验的基础上，以酶解温度、pH、料液比、酶料比为影响因子，以酶解产物的DPPH·清除率为响应值，设计了4 因素3 水平共30 个试验点的响应面法设计，对第一阶段筛选出来的木瓜酶进行生产工艺优化，功效依据实验确定。

2 结果分析与讨论

2.1 明胶的蛋白含量和氨基酸组成

样品粗蛋白含量测定为90.75%。比目前食品级明胶平均含量82%高。氨基酸组成分析结果如图1。

其中非极性氨基酸占69.23 %，甘氨酸最高占37.38%，脯氨酸15.47%；酸性氨基酸占12.87%，碱性氨基酸占8.3%。

2.2 不同酶解明胶产物对DPPH·的清除效果分析

实验在酶最适条件下用胃蛋白酶，酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶，胰蛋白酶水解猪皮明胶，依据DPPH·清除率检测抗氧化肽功效，六种酶清除率分别为78.28%、91.87%、79.94%、77.83%、36.53 %、39.42 %；方差分别为0.016、0.018、0.028、0.026、0.022、0.018。清除功效都很稳定。

图1 明胶氨基酸组成色谱图Fig.1 The chromatograph chart of amino acid composition about pigskin gelatin

结果分析：①目前，对抗氧化肽的机理尚不清楚。一般说来，构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力。Wu[12]认为，分子量较小的肽具有更高的抗氧化活性。Niranian[13]等发现，当多肽的N 端为疏水性氨基酸，抗氧化活性较高。Suetsuna[14]等表示，活性肽通过整合金属离子从而抑制以金属离子为辅酶的脂质过氧化反应。此外，抗氧化肽的活性与肽中含有的某些特殊基团有关，只有在适当分子量时，特殊基团才能得到最大的暴露表现出较强的抗氧化活性。此外，对目前研究的不同种类的明胶抗氧化肽分析发现，大多具有重复的Gly—Pro 序列[15]，猪皮明胶中这两种氨基酸含量很高，我们推测可能是水解肽抗氧化活性较高的一个原因，进一步有必要分析明胶的氨基酸顺序进行验证。②从酶的结构和pH 分类分析，酸性和胃蛋白酶属一类，活性部位含有两个羧基，在酸性范围活力最适，倾向于剪切芳香族氨基酸或亮氨酸的肽键，当氨基端为碱性氨基酸时，水解效果很差；胰和碱性蛋白酶活性中心含有咪唑基，属于丝氨酸酶，只能水解R1是精氨酸或赖氨酸的肽健，专一性很强；木瓜蛋白酶属于巯基蛋白内肽酶，作用于L-精氨酸等羧基形成的肽键，底物特异性宽泛。中性蛋白酶属于金属酶类，和木瓜蛋白酶相似，中性时效果很好。六种酶活性中心和酶解位点有差异，依据对明胶组成和当前抗氧化肽研究的分析，明胶中非极性氨基酸较多，酸性氨基酸比碱性氨基酸多，适合在酸性（中性）水解，本实验中酶类筛选与朱夕波[16]研究一致，也符合当前的理论成果。③本研究清除率高于朱夕波等的结果，原因可能如下：一是原料的不同，两者原料分子量和蛋白含量存在差异；二是加工工艺不同，朱夕波用酶组合进行水解，清除率30%左右，本研究对工艺进行改进，利用缓冲液溶涨明胶，水解过程使用了搅拌器，酶解液经高速离心和超滤处理，活性肽分子量较小。本研究显示需要对原料进行预处理，减小明胶的分子量，提高明胶产品的蛋白质含量，酶解中增加搅拌，产物进行粗分，选择合适分子量的肽段可提高功效。综合考虑，酸性蛋白酶解物抗氧化性最佳，木瓜蛋白酶等略低，但不存在统计学差异，考虑酸性蛋白酶成本较高，建议企业生产使用木瓜蛋白酶。

2.3 响应面法优化木瓜酶解条件试验结果

应用SPSS12.0 软件处理木瓜酶解数据，对pH（x1），酶解温度（x2），料液比（x3），酶料比（x4）不同因子对DPPH.清除率（y）的影响进行回归，得到方程式：

此方程式在pH（pH=3～9）、温度（30 ℃～80 ℃）、料液比（0.01～0.06）和酶料比（0.01～0.05）范围内，能较好的预测DPPH·清除率。如果扩大范围，统计学检验显著性不强（P＜0.05）。为此，应用Design Expert 8.0 软件对工艺进行优化，响应面法试验设计和结果见表2 和图2。

表2 响应面法试验设计和结果Table 2 Design and resunlts of RSM

图2 木瓜蛋白酶水解明胶制备活性肽的响应面法优化Fig．2 Papain hydrolyzed gelatin preparation of active peptide response surface methodology

温度50.05 ℃、pH 为6.16、料液比为0.043、酶料比0.04 g/g，明胶酶解多肽产物对DPPH 自由基的清除率为89.1%。采用优化的酶解条件进行验证实验，为方便操作，条件设为：温度51℃、pH 为6.16、料液比为0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，经多次实验测得多肽产物对DPPH 自由基清除率为（87.4± 0.23）%，相对误差为0.017，说明响应面法优化出的工艺可行。

3 结论

1）明胶酶解前对原料先用柠檬酸—Na2HCO3缓冲液预先溶涨，水解过程中通过搅拌器搅拌，水解物利用超滤法进行粗分，筛选分子量较小的肽段（＜4 000 u）可以提高水解物的抗氧化功效。

2）不同酶水解明胶产物抗氧化活性有差异，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶功效最佳（不存在统计学显著性），从生产成本考虑建议使用木瓜蛋白酶进行酶解。酶动力方程式y=0.330-0.011 x1-0.003 x2+2.114x3+4.646 x4在酶活力适宜条件下可以较好的预测活性肽对DPPH·的清除率。

3）用响应面法优化的最佳水解工艺条件为：温度50.05 ℃、pH 为6.16、料液比为0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，明胶酶解多肽产物对DPPH·的清除率预计可达到89.1%。实验数据为87.4%。显示这个工艺可以指导生产。酶法水解明胶还需要对酶进行固定化，相关的问题还需要继续研究。

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