季大平 李 超 刘立涛

（①山东省沂水县沙沟镇兽医站 276414 ②山东农业大学 泰安 ②山东省夏津县畜牧兽医局）

山东省部分地区产蛋鸡群低致病性禽流感免疫状况调查

季大平①李 超②②刘立涛②

（①山东省沂水县沙沟镇兽医站 276414 ②山东农业大学 泰安 ②山东省夏津县畜牧兽医局）

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病。我国流行的低致病性禽流感为H9N2 亚型禽流感，由于该病毒变异较快，传播迅速、易感鸡病情较重，使世界养禽业遭受巨大损失。为了解我省产蛋鸡群低致病性禽流感的免疫水平、流行情况，自济宁、菏泽、青岛、泰安、临沂、聊城、滨州、莱芜、德州和东营10个地区商品蛋鸡场或种鸡场采集鸡蛋或血清，进行了禽流感H9

亚型HI检测，并对送检的疑似病例进行了综合诊断。结果表明，全省各地绝大多数产蛋鸡群尤其是种鸡群的低致病性禽流感免疫状况良好，但也有部分产蛋鸡群免疫水平较低，部分鸡场已发生感染。产蛋鸡群发生低致病性禽流感一般为非典型病例，只靠症状观察、剖检病变不易判定，确诊必须进行实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 融水式电热恒温培养箱、电子天平、微量加样器(Eppendorf公司)、高速台式离心机、Anke.TGL-16G离心机(上海安亭仪器厂)、96孔V形反应板。

1.1.2 主要试剂 （1）PBS溶液的配制：氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.24g、十二水磷酸氢二钠3.63g，溶于1000ml的蒸馏水中，经滤器过滤除菌后置4℃保存备用。（2）抗凝剂(3.8%)的配制：枸橼酸钠或是柠檬三酸钠3.8g，溶于100ml的蒸馏水中。

1.1.3 样品 分别来自济宁、菏泽、青岛、泰安、临沂、聊城、滨州、莱芜、德州和东营10个地市的开产商品蛋鸡场或种鸡场送检的鸡蛋或是血清。

1.1.4 1%的红细胞悬液的制备 将适量的抗凝剂倒于10ml的离心管中，再抽取健康成年鸡的静脉血放置到离心管中混匀，2000r/min离心10min，弃上清液，再加PBS缓冲液，共重复离心洗涤3次，其中每一次都将上清液以及红细胞表面的白膜吸干净，3次完成之后，用PBS配成1%的红细胞悬液，4℃保存备用。

1.1.5 诊断试剂 H9N2标准抗原。

1.2 方法

1.2.1 红细胞凝集试验(HA) （1）取一块洁净的96孔V型微量血清反应板，用微量吸液器在两排孔中加入PBS，每孔中加入50ml。（2）取待检病毒液50ml加入第一列的第1孔中，充分混匀后取50ml加入第2孔中，如此直至第11孔，混合后吸取50ml丢弃，第12孔不加病毒为对照孔。（3）更换移液器枪头，每孔中加入50ml的1%的红细胞悬液。（4）将反应板置于微型混合器上，振动混合3min，取下置37℃温箱中保存15min，混匀，37°C温箱中放置15～20min，观察结果(表1)。

表1 禽流感病毒血凝试验 (ml)

红细胞全部凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的凝集效价64倍。

1.2.2 血凝抑制试验(HI) （1）取清洁的96孔V型微量血清反应板，在每孔中加入PBS50ml。（2）将被检血清50ml加入第一排的第1孔中，充分混匀，取50ml加入第2孔中，如此稀释直至第11孔，第12孔不加血清作为对照。（3）根据血凝试验测定的病毒效价，配制4个血凝单位的病毒稀释液。例如，上述血凝价为64倍时，将病毒原液稀释至16倍时(64/4=16)，即为4单位病毒稀释液。在每孔中加入4IU病毒稀释液50ml。（4）将反应板置于微型混合器上，振动混合3min，取下置37℃温箱中保存15～20min，观察结果。(表2)

表2 禽流感病毒血凝抑制试验 (ml)

使红细胞凝集全部被抑制的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制效价128倍，这里只选取了一个样品的结果。

通过以上方法，对送检的鸡蛋或是血清做H9的血凝和血凝抑制试验。

2 结果与分析

表3 山东省部分地区低致病性禽流感HI不同抗体滴度的比例

由上表统计的结果可以看出，各地区免疫鸡群H9亚型的HI抗体水平较高的例数，平均在75.5%，抗体水平较低的例数11.8%，其中疑似感染的鸡群比例在12.7%左右，这说明虽然有部分鸡群的免疫效果较差并且部分发生感染，但是送检地区的免疫鸡群整体免疫效果较好，H9亚型禽流感暂时不会造成严重危害。

3 结论与讨论

省内各地区禽流感H9亚型的免疫效果较好，没有出现较大范围的疫情爆发。低致病性禽流感(LPAI)是影响养禽业发展的重要疾病。近年来，在世界各地均有流行报道，对养禽业造成的经济损失十分巨大。其中，H9亚型禽流感呈地方流行、持续存在，仍然是我国目前禽流感流行的主要亚型。LPAIV导致的禽流感常以呼吸道症状、气管肿胀出血、干酪样渗出物、产蛋率下降为主要特征。本病的病程较长，发病率高，但是死亡率低。血凝试验和血凝抑制试验是实验室检测HI抗体的常用方法，该方法简单、迅速，能够较为准确的反映鸡场的流感疫苗免疫水平，监测疫情状况。虽然此次的抗体检测结果表明各地区的H9亚型禽流感防疫效果较好，但是鉴于禽流感有着重大威胁，所以还是要定期的免疫、检测，以有效地防止流感的发生。

S858.31

A

1007-1733(2013)03-0048-02

2012–12–28）