徐凤宇，李淑君，高云航，么乃全，胡静涛，李茂辉

(1．吉林农业大学动物科技学院，长春 130118;2．吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118;3．吉林正大实业有限公司，长春 130033)

新城疫(Newcastle disease，ND)自1926年被发现以来，检测到的易感动物种类不断增多，除鸡、鸽、孔雀、鹅等250多种鸟类外，也包括猪。该病病原新城疫病毒(NDV)隶属副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，依血清学反应和系统进化分析结果，本属中禽源病毒被划分为10个血清型，即禽副黏病毒1～10(APMV－1～APMV－10)，NDV被确定为APMV － 1［1］。

自1990年以来，新城疫给养鹅业造成了严重经济损失。据报道，2005－2008年分离自我国东部的禽(包括鸡、野鸽、鹅和鸵鸟)源NDV以基因Ⅶd亚型为主(57/79)［2］，这也是当前流行的鹅新城疫病毒(GPMV)的优势基因型，该型与La Sota株核苷酸同源性不高，有些仅为 84．3% 或 82．6%［3］;本室分离的MHK－1株的HN、F基因与La Sota株的相应基因核苷酸同源性分别为83%和85%;Li等［4］的研究表明，GPMV NA－1株与鸡新城疫强毒标准株F48E9有相同的抗原成分，但确实存在抗原差异;交叉攻毒保护试验结果表明，对制苗毒株的保护率高于非制苗毒株，即在用NA－1株攻毒时，F48E9株和NA－1株疫苗免疫的鸡保护率分别为60%、90%，鹅的保护率分别为70%、100%，提示传统新城疫疫苗对鹅新城疫预防效果不甚理想，所以该病仍时有发生。为了更好地防制本病，减少排毒和传播，研制理想疫苗或改善生产工艺是国内外努力的目标之一［5］。本文结合NDV的保护性抗原，就近些年鹅新城疫新型疫苗的研究现状作以综述，以期为该病的疫苗研制提供参考。

1 新城疫病毒的主要保护性抗原

NDV基因组结构模式为3’－NP－P－M－FHN－L－5’，分别编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素－神经氨酸酶(HN)和大聚合蛋白(L)6个主要多肽［6］，其中F和HN蛋白是NDV表面的主要保护性抗原，也是主要的毒力因子。

在F蛋白上第116、117位氨基酸之间有酶切位点，可被细胞蛋白酶水解，产生F1和F2两部分，大多数致病毒株在裂解位点前后有112R/K－RQ/K/R－K/R－R－F117序列，而弱毒株或无毒株此位点的氨基酸序列为112G/E－K/R－Q－G/ER －L117［7］。据报道［8］，1997 ～ 2001 年分离的大部分(10/11)毒株的F基因高度同源，但与许多NDV参考株及分离株相比，第 52、71、176、272、314、402、489位出现了特征性氨基酸变化，与同期或稍早期的鸡源NDV有较高同源性。NDV基因组全长有三种形式，其中长度为15 186 bp和15 192 bp的属于Class II，长度为 15 198 的属于 Class I［9－10］，报道的Class I毒株(如DE－R49/99)较少见，当前应用的疫苗株(La Sota等)和历史上的流行株(IT/3286/00等)多属于Class II。根据病毒F基因序列，Class II中的NDV曾被分为I－Ⅸ、XI 10个基因型;最近Diel等［11］又将602株 ClassⅡ NDV构建种系发育树，发现还包括5个新的基因型，即X、Ⅻ、XⅢ、XⅣ和XV，足见NDV处于不断变异中。

HN蛋白可结合唾液酸受体、活化F蛋白、促进病毒释放，所以在病毒入侵、成熟过程中扮演重要角色，直接影响病毒的毒力。Yuan等［12］发现无毒Ulster株HN蛋白C末端延伸区导致了功能的自体抑制，可能与其毒力弱相关。与经典的鸡源NDV相比，未发现1997－2001年分离的鹅源NDV HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列有明显不同，而在第 48、54、77、266、340、380 位出现了6 个特征性氨基酸突变［8］。另外，该蛋白存在5个最强的线性表位，即 193～201位、345～353位、513 ～521位、494 位及569位氨基酸区域［13］。

2 鹅新城疫新型疫苗

鉴于鹅新城疫对养鹅业的危害及变异株的出现，为了防控该病，在应用基因Ⅶ型灭活苗预防该病的同时，很多研究者开展了新型疫苗的相关研究，DNA疫苗、基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗均有报道，尤其是应用反向遗传技术制备的减毒活疫苗具有很大的应用潜力。

2．1 DNA疫苗 DNA疫苗可在动物机体内持续表达抗原，诱发体液免疫和细胞免疫，是当前研究的主要新型疫苗之一。刘举芳等［14］用含NA－1株的F蛋白及致弱F蛋白的真核表达质粒pCI－F、pCI－rF及La Sota疫苗分别免疫雏鸡，结果pCI－F、pCI－rF的保护力无显著差异，且二者都不及La Sota疫苗，可见单基因的DNA疫苗不宜用于鹅新城疫的免疫。

2．2 基因工程亚单位疫苗 杆状病毒表达系统具有高水平表达外源基因的特性。杨雪晶等［15］应用Bac to Bac系统在Sf9昆虫细胞中表达了GPMV的HN蛋白。毕玉海等［16］将GPMV NA－1株的F基因和鹅细小病毒(GPV)GD－01株的VP3基因用Bac to Bac系统进行表达，得到了重组蛋白F－VP3，免疫雏鹅后可诱导鹅产生抗GPMV HI抗体和抗GPV中和抗体。

毕赤酵母表达系统可使外源蛋白更具天然生物学活性，冯新等［17］将 GPMV NA －1株的 F、HN基因分别转化至感受态毕赤酵母中，获得酵母表达的F和HN蛋白，均可与GPMV多克隆抗体发生特异性反应。

但到本文截稿为止，未见有应用基因工程亚单位疫苗进行免疫保护试验的相关报道，是否可应用于临床预防鹅新城疫尚需进一步研究。

2．3 重组活载体疫苗 痘病毒载体可容纳较多的外源基因。杨玉菊等［18］构建了GPMV的HN和F基因的重组禽痘病毒，二者在鸡胚成纤维(CEF)细胞中获得表达并表现出良好的反应原性。于志丹等［19］将GPMV的F基因与GPV的VP3基因连接，转染禽痘病毒感染的CEF细胞，获得了有效表达，且两种蛋白都保持反应原性。

减毒沙门菌作为载体可激发强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫。潘志明等［20］构建了含GPMV JS5株F基因的重组沙门菌SL7207(pVAX1－F)，表明其对雏鸡的免疫保护率为77．27%，明显高于空载体对照组。以上试验为进一步研制活载体疫苗奠定了基础。

2．4 减毒活疫苗 反向遗传技术可快速、定向致弱毒株，在控制ND的发生和流行方面有较大优势和潜力，与强毒株相比，致弱毒株能有效降低攻毒后试验动物的排毒量。Hu等［21］将F蛋白裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸，即由112R－R－Q－K－R－F117变为112G－R－Q－E－R－L117，应用反向遗传技术拯救出了弱毒株NDV/ZJ1FM;由于该毒株的 EID50较低，又将HN基因替换成JS5/05株(HA=9log2)的HN，拯救出的病毒被命名为NDV/ZJ1HN，体外试验表明NDV/ZJ1HN株的最小致死剂量鸡胚平均死亡时间(MDT)超过120 h，对1日龄雏鸡的脑内致病指数(ICPI)为 0．16，EID50为 109．1/mL，血凝价为9log2;后续免疫保护试验表明，NDV/ZJ1HN株活苗或灭活苗能有效保护致死量的JS5/06株GPMV的攻击，与La Sota株免疫鸡、鹅相比减少了排毒量。Hu等［22］以基因Ⅶ型JS5/05毒株为研究对象，通过反向遗传操作改变了F蛋白裂解位点的氨基酸序列，制备出了无毒的NDV/AI4株病毒，用鸡胚连续培养10代表明复制有效且遗传稳定，其油乳胶苗诱导的鸡和鹅的HI抗体产生较快且效价均高于La Sota苗，用JS3/05攻毒的保护试验表明能提供有效保护，且免疫动物的排毒量明显低于La Sota苗。孙玉章也应用反向遗传技术及NA－1株GPMV构建了人工致弱的病毒株rNA－1－F’，测得的MDT为96 h［23］。以上研究为 GPMV弱毒疫苗的生产及商品化奠定了基础。

3 展望

目前常规疫苗仍是预防鹅新城疫的首选，新型疫苗研究方兴未艾，很多新技术也应用于此，但仍处于研究阶段。新的措施也可尝试:一是多表位、多蛋白疫苗或加有分子佐剂或密码子优化的疫苗。程宝艳等克隆了NDV F基因的3段抗原表位，拼接成多表位串联基因，表达的蛋白抗原性良好，用其制备了鼠源抗 NDV F 蛋白抗体［24］;曾伟伟［25］将NDV的F基因密码子优化为鸡体内偏嗜的密码子，分别构建了重组质粒pVAX1－optiF和pVAX1－F，前者对鸡的免疫保护率(12/12)显著高于后者(2/12);用IL－2和不同拷贝数的C3d作为分子佐剂构建的质粒诱导的保护性体液免疫、细胞免疫以及对强毒攻击的保护效果均好于相应的其他质粒。Loke等［26］将构建的基因疫苗 pEGFP－HN和pEGFP－F分别皮下注射免疫SPF雏鸡，对强毒的保护率分别为33．3%和50．0%;而用pEGFP－HN和pEGFP－F共同免疫保护率达90%。二是考虑转基因植物口服疫苗或以其他材料为载体的疫苗。转基因植物口服疫苗的植物载体易于保存，使用方便，市场潜力大，发展前景十分广阔。杨振泉等曾以NDV的F为外源基因，用水稻作为表达系统，将NDV－F基因稳定整合到水稻基因组中并表达，免疫小鼠后可诱导产生一定水平的NDV－F蛋白特异抗体［27］，但转基因疫苗的安全性需要有足够的证据支持;Palya等以火鸡疱疹病毒为载体构建了NDV的F基因重组疫苗，卵内和皮下接种Broiler鸡，也收到了较好的免疫效果［28］。

除APMV－1外，APMVs 2－4、6－9也被从家禽或野鸟中分离到，偶尔会引起呼吸和繁殖疾病。Laura等［29］从2000－2005年9128份岸禽和鸥的泄殖腔拭子中分离到60株禽副黏病毒，其中41株为APMV－1，19株为APMV－2，推测新城疫病毒继续变异也完全可能。另外，即使是基因Ⅶ型NDV，也不仅感染鹅，还感染鸡，对鸽也具有较强的致病性［30］。所以，研制有效、减少排毒的疫苗对养禽业十分重要。根据OIE的规定［1］，为保证疫苗的安全性，NDV弱毒苗种毒的ICPI值要不高于0．4，值得研究者借鉴。

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