汪敬业罗本燕汪凯

·综 述·

非凋亡性的程序性死亡在神经疾病中的作用☆

汪敬业*罗本燕△汪凯*

神经元 程序性死亡 程序性坏死 自噬凋亡

细胞死亡方式分为程序性死亡（programmed cell death，PCD）和非程序性死亡，目前已经阐明的程序性死亡方式有凋亡、自噬性死亡和程序性坏死等3种类型[1]。由于认识的局限，相当长时间内凋亡（apoptosis）和PCD基本等同，而坏死被归为非程序性死亡，因此既往PCD研究主要集中在凋亡上。近年发现了两种非凋亡性的PCD：自噬性死亡（autophagic cell death）和程序性坏死（programmed necrosis或necroptosis），研究发现这两种PCD在神经元死亡中同样扮演重要角色，参与多种神经系统疾病的发生，成为当前研究的热点领域，其机制的阐明将有助于探寻到更多治疗神经疾病的有效措施。本文结合国内外研究成果及我们前期的研究对神经元程序性死亡方式及其相互关系加以综述，并阐述某些评价细胞死亡方式的方法学缺陷，以加深对神经元死亡机制的了解，减少对实验结果解释的偏倚，从而便于指导基础和临床研究。

1 凋亡

已有不少综述阐述凋亡在神经系统疾病中的作用，本文主要简述凋亡检测方法学及其缺陷。细胞死亡方式的识别包括形态学改变、信号分子以及特异性标记物的出现，其中形态学改变以及特异性标记物是判断细胞死亡类型的主要依据，电镜下的形态学改变是金标准。以下几个条件常作为凋亡的判断标准：①具备凋亡的形态学特征；②原位末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transfer⁃ase dUTP nick end labeling，TUNEL染色）阳性；③电泳时呈现“DNA梯带”；④凋亡分子标记物出现。既往不少文献仅检测其中一个指标即判定为细胞凋亡，其中TUNEL染色阳性和“DNA梯带”使用尤其多[2]。但越来越多的研究表明TUNEL染色并不能很好地区别细胞凋亡与非细胞凋亡，在坏死和自溶性死亡中也会出现TUNEL染色阳性细胞[2-3]。细胞凋亡时DNA不仅可裂解成180～200 bp片断，也可裂解为300 bp～50 kbp的片断，甚至不出现“DNA梯带”；相反，在坏死的早期同样可出现“DNA梯带”，说明“DNA梯带”也非细胞凋亡的特异性判定标准[2-3]。电镜下见到凋亡形态学结构是判定凋亡的金标准，但某些切面的电镜照片可出现核内假包涵体（核膜内陷）或染色质外突，这些结构容易被误认为凋亡[3]。大鼠全脑缺血模型研究中发现海马CA1区死亡神经元TUNEL染色阳性，但未见凋亡标记物caspase-3的激活，电镜下也未观察到经典的凋亡结构[4]，这些结果进一步说明脑缺血损伤时TUNEL染色阳性并不代表神经元发生凋亡。

2 自噬

适度的自噬能实现物质和能量的再利用，有助于维持细胞的功能和存活，然而自噬的过度发生也可诱导细胞死亡。在神经系统发育、脑缺血缺氧、癫痫、神经系统退行性疾病、神经系统感染等疾病研究中电镜下可观察到自噬泡及自噬溶酶体的形成，分子生物学方面能检测到自噬标记物LC3、Atg、Beclin 1等基因或蛋白的表达增加。采用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）、Wortman⁃nin或Bafliomycin A1（BFA）以及敲除Atg、Beclin 1等自噬相关基因后能够减少神经元死亡，改善小鼠的行为学，这些结果表明自噬广泛参与神经系统疾病的发生与发展[5-7]。虽然上述疾病神经元死亡过程中伴随有自噬的形成，但自噬在神经系统变性病的神经元死亡中的确切作用尚不确切，适度的自噬可能有助于神经元的存活，而自噬过度才导致神经元死亡[5-7]。脑缺血后自噬的激活是诱导神经元死亡还是促进神经元存活尚未取得一致的结论，有结果表明自噬在其中发挥保护作用[5-6,8]。我们在全脑缺血诱导的海马神经元死亡研究中电镜下检测到自噬结构的形成，LC3-II表达增加，说明自噬有激活，采用自噬阻断剂3-MA能减轻神经元死亡，但电镜下神经元死亡形态学符合程序性坏死。迄今，自噬性死亡的研究中仍缺乏如凋亡中的凋亡小体那样的形态学判定标准，观察到自噬结构只能说明有自噬发生，但并不代表细胞一定为自噬性死亡，上述我们脑缺血后神经元死亡的研究结果也支持这一结论。研究表明常用的自噬阻断剂3-MA除抑制溶酶体酶释放外还能抑制细胞色素C的释放、caspase-3的激活以及溶酶体酶cathepsin B的释放，这些结果表明自噬阻断剂除抑制自噬外尚有其他的保护机制，提示不能仅根据自噬阻断剂有保护作用即完全判定细胞为自噬性死亡[4,9]。此外，我们对结果的解释时也需注意到不同的自噬抑制剂分别作用于自噬的不同阶段，如自噬的起始阶段（3-MA，Wortmannin），自噬泡和溶酶体融合阶段（BFA），以及溶酶体内的降解阶段。

3 坏死与程序性坏死

3.1 坏死 细胞坏死通常为一种病理性死亡，既往认为坏死是一个被动的死亡过程，其形态学特征是：细胞及细胞器肿胀，线粒体空泡变性，溶酶体破坏伴溶酶体酶外泄，核浓缩、核碎裂及核溶解等改变，细胞膜破裂和细胞质外溢，坏死的细胞成分在邻近组织中引起炎症反应。局灶性脑缺血梗死中心区、脑缺血缺氧、中毒、脑死亡等急性损伤性疾病中神经元和胶质细胞在损伤后数分钟至数小时内快速死亡，形态学上符合坏死特征。

3.2 程序性坏死 近期，越来越多的实验发现某些类型的坏死同样可受到诸多因素的精确调控，表现为程序性死亡过程，称为程序性坏死[10-11]。程序性坏死的死亡形态学特征类似坏死，即有细胞膜、细胞器和细胞核的肿胀、破坏等形态学改变；但却是死亡受体、受体相互作用蛋白（recep⁃tor-interacting protein，RIP）中RIP1和RIP3、混合系列蛋白激酶样结构蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）[12]、线粒体磷酸酶PGAM5（phosphoglycerate mutase family member 5）[13]、NAD依赖的去乙酰化酶SIRT2（sirtuin 2）[14]等信号分子参与调控的程序性死亡过程，其中RIP3是细胞凋亡与坏死相互转换的分子开关[10,12-17]。目前阐明的程序性坏死信号通路大致分为如下3个阶段：第一阶段包括TNF受体、嘌呤受体、NMDA受体激活以及DNA损伤；第二阶段是钙超载、神经酰胺、ROS产生、ATP消耗、聚ADP核糖聚合酶激活、脂质过氧化等细胞代谢以及线粒体、溶酶体通透性增加等细胞器改变；最后阶段是蛋白酶的激活，使质膜通透性增加、核裂解，出现坏死的形态学改变[18-19]。

目前发现的程序性坏死特异性的抑制剂有necro⁃statin-1（nec-1）和necrosulfonamide（NSA），Nec-1通过抑制RIP1激酶活性从而抑制RIP3磷酸化[11,15,20]，而NSA通过特异识别MLKL从而阻止坏死信号的传导[12]。研究表明Nec-1可以减小局灶性脑缺血梗死面积、新生小鼠缺血缺氧性神经元死亡、减轻NMDA诱导的神经元毒性损害[11,21-22]。此外，癫痫、神经退行性疾病、病毒感染等疾病过程中均可见到程序性坏死的参与[19,23]。我们研究发现成年大鼠全脑缺血诱导海马神经元迟发性死亡，TUNEL染色阳性，电镜下可见自噬的激活，细胞器水肿、断裂，细胞膜、核膜消失、核裂解、溶酶体酶cathepsin B释放等细胞坏死特征，上述特点符合程序性坏死，说明全脑缺血诱导的神经元死亡实际为程序性坏死[4]。既往部分研究根据TU⁃NEL染色阳性、DNA梯带或蛋白质合成抑制剂能减轻其死亡等结果认为全脑缺血后神经元死亡方式为凋亡，也有部分研究根据形态学改变判定为坏死[24]，程序性坏死的发现很好的统一了这两种矛盾性的研究结论。

10.3936/j.issn.1002-0152.2013.09.013

☆ 国家自然科学基金（编号：81100877，81271272）；教育部博士点基金—新教师类基金（编号：20113420120003）

*安徽医科大学第一附属医院神经内科(合肥230022)

（E-mail：wangkai1964@126.com）

△浙江大学医学院附属第一医院脑研究中心、神经内科