倪晓艳 曹 文

（辽宁省东港市中医院检验科，辽宁 东港 118300）

乙型肝炎病毒基因分型方法的研究进展

倪晓艳 曹 文

（辽宁省东港市中医院检验科，辽宁 东港 118300）

目的 为建立一种快速、直接、简单以及经济的乙型肝炎病毒基因分型的方法，并且能够便于大批量的标本检测。方法 从前S1基因到S基因中的序列设计出10条内外引物，并将其中4条内引物扩增A B C 型乙型肝炎病毒，然后将第2 轮PCR的产物用1.5%琼脂糖进行电泳，根据凝胶成像分析系统所显示的PCR产物片断大小直接判定HBV基因型。结果 本文应用乙型肝炎病毒PCR分型方法，结果可靠。检测以基因C型为主，与文献报道结果一致。PCR扩增结果显示，200例HBV DNA基因分型：B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），两例基因型不明。重复性试验：基因分型鉴定结果前后符合率为100%。结论 我们采用型特异性引物经两轮PCR分别扩增A-C型HBV，从PCR 产物片段的大小即可直接判定HBV 基因型，此方法特异性高，简单，容易操作等。

乙型肝炎病毒基因；基因型；PCR扩增

HBV在漫长的岁月中累计的点突变构成不同的基因型，基因型的提出为HBV的研究开辟了新的领域[1]。本实验采用型特异性引物PCR扩增法对200例江浙沪地区乙型病毒性肝炎患者进行了HBV基因分型，并采用琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行分型，根据凝胶成像系统对所得图像进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本血清

收集2009年3月至2009年4月杭州迪安医学检验中心PCR科室筛选的乙型肝炎病毒阳性的标本200例（此标本由罗氏LightingCycler480高通量实时荧光定量PCR仪检测出HBV DNA＞1×103copy/ml）。

1.1.2 基因提取、扩增和电泳主要试剂

血清DNA提取所用试剂购自上海克隆生物高技术有限公司；PCR反应体系由迪安科研部自备，其中Taq酶与MgCl2购自Fermentas公司，dNTP则购自Keygene公司；引物由上海英骏（invitrogen）生物技术有限公司合成，琼脂糖购自北京凌峰源生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

HB-100恒温金属浴仪为杭州博日科技有限公司产品，PCR仪为杭州朗基科学仪器有限公司生产的LongGene-MG96G型，离心机为贝克曼（BeckMan）公司的Microfuge I6，电泳仪为上海复生生物工程研究所生产的FS-600，全自动数码凝胶成像分析仪为上海培清科技有限公司生产的JS-380C。

1.2 方法

1.2.1 标本准备

杭州迪安医学检验中PCR科室的对常规血清标本用罗氏LightingCycler高通量实时荧光定量PCR仪检测，检测阳性标本送科研室进行乙型肝炎病毒分型实验。

1.2.2 血清DNA模板提取

按照试剂盒说明书进行，主要步骤为：取50μL待测血清样本加入50μL核酸提取液A，振荡混匀10min，12000rpm离心10min，弃去上清；再加入50μL核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10s，100℃金属浴10min，12000rpm离心2 min，取2μL上清液作为模板。

1.2.3 PCR扩增

PCR 按Naitoetal[2]方法进行稍作改动。首先用一对外引物（P1、Ps）进行第1轮PCR，在0.2mLPCR管中依次加入通用引物P1（10 μmol/L）0.8μL，Ps（10μmol/L）0.8μL，dNTP（10mM）0.8μLTaq 聚合酶（1μ/mL） 0.4μL，10×PCR 缓冲液（含20 mM Mg2+） 2.5μL，血清DNA提取物1μL。扩增条件为94°C 预变性5min，94°C 变性60s，55°C退火45s ，72°C延伸90s，30个循环后72°C再延伸5 min。然后分别以B2、BA1R、BB1R、BC1R为内引物进行第2 轮PCR，分别检测A型、B型和C型乙型肝炎病毒。第二轮乙型肝炎病毒PCR 反应体系中除引物外的其余成分同第1轮PCR，扩增条件为95°C预变性10min ，94°C变性20s，58°C退火20s，72 °C延伸30s，40个循环后72°C再延伸10min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳及数据分析

用微量加样器将DL2000 marker 5μL、PCR产物8μL及阴性对照和空白对照分别加样于1.5%琼脂糖凝胶，进行电泳。

2 结 果

用特异性引物可分出乙型肝炎病毒 DNA片断分别为281bp和122bp的HBV DNA B型和C型，，同时出现281bp和122bp条带者为BC混合型。

2.1 200例HBV DNA基因分型

B型28例（14%），C型169例（84.5%），B、C混合型1例（0.5%），两例基因型不明。

2.2 重复性试验

200份患者血清中随机挑选20份，多次应用方法分型，基因分型鉴定结果前后符合率为100%。

3 讨 论

HBV 基因型与乙肝的传染性、临床疾病预后判断及抗病毒药物治疗的选择具有一定的相关性，因此对HBV基因型的检测意义重大。目前现有的分型方法尚有些许不足如直接测序法相对最为准确，但测序时间长、成本高、需反复比较分析才能得出结论，无法进行大样本量的流行病学研究[3]；一般的PCR-RFLP分型法大多也是扩增后再测序比直接测序法也只稍微节省成本，而且此法所需时间较长，步骤多，混合感染或酶切不完全时出现复杂条带，结果难以判断[4]。微板核酸杂交ELISA 法虽然特异性较高，但杂交后需复杂的显色步骤，杂交背景也很容易受各种因素的干扰。

本研究采用型特异性引物PCR扩增法进行基因分型，在严格的PCR条件下根据产物片断的大小判断基因型别方法较为简便快速，特异型高，检测费用较低。但由于有些样本的HBV浓度较低或其他原因使结果呈假阴性而导致无法分型或会出现较复杂的带型从而不利于结果判断，尤其当同一标本混有两种基因型时更无能为力，另外由于HBV基因变异的多样性，巢氏PCR分型法不能鉴定100%的样品。今后还需进行更多的临床研究和实验。

总之应用型特异性引物PCR方法进行HBV基因型检测，方便，准确，成本低，可用于大规模的流行病学调查。

[1] 陈钟先,齐舒,方勇.湖北地区乙型肝炎病毒基因型分布与临床的相关性[J].中华肝脏病杂志,2006,25(2):214-217.

[2] De Castro L,Araujo NM,Sabino RR,et al.Nosocomial spread of hepatitis B virus in two hemodialysis units,investigated by restriction fragment length polymorphism analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis ,2000,19(7):531-537.

[3] OkamotoH, Tsuda F, TanakaT,et al.Typing hepatitisB virusby ho-mology in nucleotide sequence: comparison of surface subtype[J]. J Gen Virol,1988,69(10):2575-2583.

[4] 杨胜得,何秉贤.乙型肝炎病毒基因型及临床意义[J].中华传染病杂志,2001,29(3):187.

R512.6+2

B

1671-8194（2013）01-0077-02