马燕燕 虞朝辉 厉有名

●综 述

共聚焦激光显微内镜在上消化道疾病中的应用新进展

马燕燕 虞朝辉 厉有名

近年来内镜的发展得到了很大的提升，其中共聚焦激光显微内镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）是目前国际上最新的内镜技术之一。它在传统电子内镜的基础上集成了共聚焦激光显微成像系统，可将内镜图像放大1 000倍左右。同时，它可对黏膜进行一定深度的断层扫描成像，观察腺体、细胞核微血管的显微结构，有助于内镜下作出组织学诊断并指导靶向活检。

1 CLE的原理

CLE是将传统电子内镜的头端整合上一个小型的共聚焦激光显微镜，激光源发出的波长为488nm的激光束，激发被检组织中的荧光物质，发出不同方向的荧光，经光源针孔及透镜聚焦于被观察平面某一点，该点反射光经同一透镜聚焦于观察针孔形成点像，并通过针孔被探测器接收。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种成像方式为共聚焦成像。当激光逐点扫描检测组织，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。将焦平面依次位于检测组织的不同层面上，便可以逐层获得组织相应的光学横断面的图像，称为“光学切片”。在内镜检查的同时获得黏膜不同层面的“光学切片”，因此被誉为“光学活检”。

2 CLE在上消化道疾病诊断中的应用

Martinez等[1]用24h食管pH检测发现非糜烂性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）的异常率只有50%左右，诊断NERD的敏感性0%～71%，特异性85%～100%，因此NERD患者常规行24h食管pH监测并非必要。随着内镜技术的发展，有研究发现NERD患者虽然不存在食管黏膜的破损，但是存在一些微小病变，例如齿状线上血管网或血管斑、黏膜表面绒毛感、黏膜岛的形成及微糜烂[2]，这些发现均有助于NERD的诊断。同时，CLE还能更清晰地观察到食管黏膜上皮乳头内毛细血管袢形态、管径的变化和细胞间隙增宽，而这些变化在诸多的研究中都被证实了其在NERD临床表现及诊断中的意义[3]，因此CLE为NERD的诊断提供了新的有价值的检查方法。

Barrett食管（BE）是指食管下段黏膜的复层鳞状上皮被单层柱状上皮所替代的一种病理现象，属于一种癌前病变。典型的Barrett食管化生柱状上皮形态呈绒毛状，与贲门或胃柱状上皮不同，其特征性的杯状细胞也很容易识别。目前BE的诊断基于内镜与病理组织检查的统一，但内镜诊断率较高而组织病理诊断率较低的脱节现象普遍存在。Kiesslich等[4]首先报道了将CLE用于BE诊断，其敏感性和特异性分别为99.9%和94.4%，他在进一步研究中又报道了CLE在诊断BE上皮化生的准确性为96.8%，BE瘤变的准确性为97.4%[5]。随后，Becker、Liu和Dunbar等[6-8]也通过调查研究得出相似的文献报道，其中Dunbar等[8]采用双盲、随机交叉试验研究了46例BE患者，其中18例疑似伴有上皮内瘤变患者，与普通内镜下的四象限活检相比，CLE下的靶向活检对上皮内瘤变的检出率明显提高（33.7%比17.2%）。2011年Sharma的一项国际多中心合作研究表明相对于白光内镜和色素内镜，CLE灵敏度大幅度提高，而用基于探针的CLE（probe-based CLE，pCLE）结合白光和色素内镜，对BE患者检测时灵敏度可达100%，阴性预测值可达100%，对可疑部位进行活检可以避免76%的活检。Johnson等[9]报道了4例pCLE为BE患者的诊治研究，发现pCLE不仅能降低活检数量，提高活检阳性率，而且CLE能确定对治疗效果进行现场评估，确定后续治疗方案。随着研究的进展，CLE在Barrett食管的诊断中作用会显得越来越重要。

20世纪90年代之后，色素内镜的应用使得早期鳞癌的检出率大大提高，有研究显示卢戈液喷洒可检出100%高级别上皮内瘤变，而普通内镜仅有55%[10]。然而单纯应用碘染筛检食管瘤变组织，将会增加许多不必要的活检，而且卢戈液的碘剂过敏、食管痉挛等不良反应限制了其临床应用。内镜技术的革新使得激光共聚焦显微内镜能观察到消化道黏膜的单个上皮细胞和微血管形态。Deinert等[11]最早描述了1例早期食管鳞癌在CLE下的图像特点，后来其病理证实为高分化鳞癌。Pech等[12]也单独应用荧光素钠显影，通过观察共聚焦下鳞状上皮细胞和乳头内毛细血管袢形态的改变诊断早期食管癌。由此可得知，不规则排列的鳞状上皮细胞、增粗或扭曲血管团状或长分支状的乳头内毛细血管袢是食管浅表鳞癌共聚焦图像的显著特征，其敏感性和特异性高达92.8%和100%。再者，肿瘤细胞的一个重要病理特征就是细胞核体积增大，核质比增大。因此使用吖啶黄荧光对比剂后，CLE可发现食管高级别上皮内瘤变和早期鳞癌在浅层的明显增大的细胞核，能进一步对其进行诊断。

2005年，Kiesslich等[13]首次报道了CLE在Hp诊断中的应用，他发现胃内有吖啶黄着色的聚集或单个菌体，用共聚焦图像放大后甚至可见单个细菌的菌体和鞭毛，观察部位取活检行银染、免疫组化、尿素试验及活检组织培养均证实为Hp感染。随后Hoffman等[14]也尝试了用CLE，利用吖啶黄染色来诊断Hp感染。

我国胃癌病死率居世界首位，胃癌及癌前病变的内镜诊断率总体不高。众所周知，胃癌前病变的病理组织学特征是胃黏膜的不典型增生及含有杯状细胞的肠化生上皮，而早期胃癌的病理学特点是细胞结构异常、染色质凝聚和核浆比例增大，两者共聚焦图片完全不同，很容易鉴别诊断。Kitabatake等[15]利用CLE对27例早期胃癌患者进行了观察发现腺体和黏膜微血管排列不规则，将共聚焦图像与病理组织学图像进行对方后，提示共聚焦图像完全可以进行实体组织性诊断。之后，Kakeji等[16]也通过对研究证实可以依据共聚焦图像来诊断早期胃癌。共聚焦内镜还观察到胃黏膜微血管的改变，正常胃黏膜的微血管结构呈蜂窝状或螺管形，规则分布于胃小凹周围，分化型胃癌血管明显增多、形状和管径各不相同，而未分化型胃癌则微血管明显减少，呈不连续的短枝状[17]。因此，将微血管结构和胃小凹的结构结合加以分析将更有助于对早期胃癌的诊断。

正常十二指肠黏膜无小凹表现，表面覆盖典型的柱状上皮细胞，可见大量杯状细胞，深部微血管网密集。1995年，Holmqren等[18]应用共聚焦内镜发现乳糜泻患者的十二指肠黏膜细胞骨架是紊乱的。乳糜泻患者的共聚焦显微内镜能够显示绒毛萎缩和上皮内淋巴细胞数目增多，方便快速地在体诊断乳糜泻。Leong等[19]对乳糜泻患者的十二指肠黏膜作CLE与组织病理学检查，比较结果显示CLE诊断乳糜泻具有很高的优越性：敏感性94%、特异性92%。

CLE作为一项新型诊断工具，虽然应用于临床的时间不长，但是其临床价值却日益重要。共聚焦内镜的出现标志着内镜检查从表层走向深层、从宏观到微观、从形态学迈向组织学的质变。不仅如此，荧光对比剂的应用可在显微内镜下进行特异性染色，不仅更易发现早期肿瘤及癌前病变，而且对肿瘤靶向治疗也是CLE进一步研究的方向。因此，CLE所具有的独特优势必将对上消化系统疾病的诊断产生划时代的意义。

[1] Martinez S D,Malagon I B,Garewal H S,et al．Non-erosive reflux disease(NERD)-acid reflux and symptom patterns[J]．Aliment Pharmacol Ther,2003,17(4):537-545．

[2] Kiesslich R,Kanzler S,Vieth M,et al．Minimal change esophagitis:prospective comparison of endoscopic and histological markers between patients with non-erosive reflux disease and normal controls using magnifying endoscopy[J]．Dig Dis,2004,22: 221-227．

[3] Orlando L A,Orlando R C．Dilated intercellular spaces as a marker of GERD[J]．Curr Gastroenterol Rep,2009,11(3):190-194．

[4] Kiesslich R,Burg J,Vieth M,et al．Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo[J]．Gastroenterology,2004,127(3):706-713．

[5] Kiesslich R,Gossner L,Goetz M,et al．In vivo histology of Barrett's esophagus and associated neoplasia by confocal laser endomicroscopy[J]．Clinical Gastroenterology and Hepatology,2006, 4(8):979-987．

[6] Becker V,Vieth M,Bajbouj M,et al．Confocal laser scanning fluorescence microscopy for in vivo determination of microvessel density in Barrett's esophagus[J]．Endoscopy,2008,40:888-891．

[7] Liu H,Li YQ,Yu T,et al．Confocal laser endomicroscopy for superficial esophageal squamous cell carcinoma[J]．Endoscopy, 2009,41:99-106．

[8]Dunbar K B,Okolo P,Montgomery E,et al．Confocal laser endomicroscopy in Barrett's esophagus and endoacopically inapparent Barrett's neoplasia:a prospective,randomized,double-blind, controlled,crossover trial[J]．Gastrointest Endosc,2009,70:645-654．

[9] Johnson E A,De Lee R,Aqni R,et al．Probe-Based Confocal Laser Endomicroscopy to Guide Real-Time Endoscopic Therapy in Barrett's Esophagus with Dysplasia[J]．Case Rep Gastroenterol,2012,6(2):285-292．

[10] Hashimoto C L,Iriya K,Baba E R,et al．Lugol's dye spray chromoendoscopy establishes early diagnosis of esophageal cancer in patients with primary head and neck cancer[J]．Am J Gastroenterol,2005,100(2):275-282．

[11] Deinert K,Kiesslich R,Vieth M,et al．In-vivo microvascular imaging of early squamous-cell cancer of the esophagus by confocal laser endomicroscopy[J]．Endoscopy,2007,39:366-368．

[12]Pech O,Rabenstein T,Manner H,et al．Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus[J]．Clin Gastroenterol Hepatol,2008,6:89-94．

[13] Kiesslich R,Goetz M,Burg J,et al．Helicobacter pylori in vivo by confocal laser endoscopy[J]．Gastroenterology,2005,128: 2119-2123．

[14] Hoffman A,Goetz M,Vieth M,et al．Confocal laser endomicroscopy:technical status and current indications[J]．Endoscopy,2006,38:1275-1283．

[15] Kilabatake S,Niwa Y,M iyahara R,et al．Confocal endomicroscopy for the diagnosis of gastric cancer in vivo[J]．Endoscopy,2006,38(11):1110-1114．

[16]Kakeji Y,Yamaguchi S,Yoslfida D,et al．Development and assessment of morphologic criteria for diagnosing gastric cancer using confocal endomiroscopy:an ex vivo and in vivo study[J]．Endoscopy,2006,38(9):886-890．

[17] Liu H,Li Y Q,Yu T,et al．Confocal endomicroscopy for in vivo detection of microvascular architecture in normal and malignant lesions of upper gastrointestinal tract[J]．J Gastroenterol Hepatol,2008,23(1):56-61．

[18]Holmqren P K,Maqnusson K E,Stenhammar L,et al．Confoeal laser scanning microscopy of small-intestinal mucosa in celiac disease[J]．Scand J Gastroenterol,1995,30(3):228-234．

[19] Leong R W,Nquyen N Q,Meredith C G．et al．In vivo confocal endomicroseopy in the diagnosis and evaluation of celiac disease[J]．Gastroenterology,2008,135(6):1870-1876．

2013-03-21）

（本文编辑：沈昱平）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院消化内科

厉有名，E-mail：zlym@zju.edu.cn