胡平

（南京医科大学附属南京妇幼保健院，江苏 南京 210004）

1 原文摘要

The purpose of this study was to determine the deep sequencing and analytic conditions needed to detect fetal subchromosome abnormalities across the genome from a maternal blood sample.Cellfree（cf）DNA was isolated from the plasma of 11 pregnant women carrying fetuses with subchromosomal duplications and deletions，translocations， mosaicism， and trisomy 20 diagnosed by metaphase karyotype.Massively parallel sequencing（MPS）was performed with 25-mer tags at approximately 109tags per sample and mapped to reference human genome assembly hg19.Tags were counted and normalized to fixed genome bin sizes of 1Mb or 100 kb to detect statistically distinct copy-number changes compared to the reference.All seven cases of microdeletions，duplications，translocations，and the trisomy 20 were detected blindly by MPS，including a microdeletion as small as 300 kb.In two of these cases in which the metaphase karyotype showed additional material of unknown origin，MPS identified both the translocation breakpoint and the chromosomal origin of the additional material.In the four mosaic cases，the subchromosomal abnormality was not demonstrated by MPS.This work shows that in nonmosaic cases，it is possible to obtain a fetalmolecular karyotype by MPS ofmaternal plasma cfDNA that is equivalent to a chromosome microarray and in some cases is better than a metaphase karyotype.This approach combines the advantage of enhanced fetal genomic resolution with the improved safety of a noninvasive maternal blood test.

2 论文核心内容及点评

该文章于2013年2月发表于《The American Journal of Human Genetics》杂志。在该研究中，作者主要评估了采用孕母血浆高通量测序进行胎儿全基因组范围内染色体微缺失／微重复无创产前检测的技术条件及其检测效果。主要内容如下：

已有的研究表明，与常规G显带技术相比，染色体微阵列芯片技术（chromosome microarrays，CMA）用于产前诊断可以显著提高染色体异常检出率，尤其是G显带无法检出的微缺失／微重复。因此CMA具有着良好的临床应用价值，在一些国家已被推荐成为一线检测技术。但是该技术仍需要通过侵入性的手段进行胎儿细胞取材，必须配备临床取材经验丰富的妇产科医生，并可能导致胎儿流产。那么，是否有一种技术可以实现非侵入性的胎儿染色体微缺失／微重复无创伤检测呢？

通过母体血浆游离DNA高通量测序检测胎儿常见染色体非整倍体异常（21、13、18）已有大量的研究报道，并逐渐成为临床上一种替代侵入性检查的新型方案。这种方法是否可能实现全基因组范围内的染色体亚显微异常检测呢？作者认为，这种方法理论上是可行的。事实上，关于微缺失／微重复的无创产前检测研究已有5例成功的病例报道。第一篇研究报道通过母体血浆游离DNA高通量测序在一位35孕周孕妇血浆中成功检测出1例4.2 Mb大小的12p11.22-12.1微缺失；另一个研究小组的报道采用该技术检测出了2例22q11.2微缺失；在该作者前期研究中也报道了1例11q21-23微缺失和6q重复的无创产前诊断。

该研究内容分为2部分。第一部分是方法学验证，血浆DNA的测序深度和胎儿DNA浓度对于胎儿染色体无创性检测效果具有重要意义，作者为了确定所选择的测序深度是否可以检出全基因组范围内的微缺失／微重复及孕妇血浆中胎儿DNA相对浓度，采用了“人为掺入”策略模拟出胎儿染色体异常的孕妇血浆DNA样本。将确诊的染色体异常男性患儿及其母亲基因组DNA打断为200 bp大小的短片段，以模拟血浆中的游离DNA长度，并制备成患儿DNA／总DNA＝5%和10%两种浓度混合DNA样本共4组，进行了高通量测序测试。测序采用的是36bp的单向测序，获得的reads数目（400～750）*106，4例标本包括21三体、7号染色体部分缺失、22号染色体部分重复、嵌合型15号染色体部分重复各一例，这4例检测结果均与arrayCGH结果一致，且所测得的胎儿DNA相对浓度与实际掺入浓度基本一致。

第二部分是阳性孕妇血浆样本的双盲实验。作者选取怀有染色体异常胎儿的孕妇血浆11例，采用的是25 bp的单向测序，每个标本获得的reads数目（0.6～1.3）*109。标本中包括1例20号染色体三体，染色体缺失5例、重复4例，涉及到3、6、7、8、10、15、17、X号染色体，包括嵌合体标本4例，其中亚显微缺失／重复4例。检测结果：7例标本被成功检出，所检出的最小CNV为300 kb；2例含有不明染色体来源的标本被准确检出；1例嵌合型微缺失检出，3例嵌合型微缺失无法检出。

本研究结果的几个方面具有重要的价值：①该技术可以检出除嵌合型之外的全基因组范围染色体微缺失／微重复异常，检测效果与胎儿细胞DNA的微阵列比较基因组杂交效果接近；②25 bp测序长度和109的测序深度条件已经可以达到100 kb的检测分辨率，显著高于常规侵入性染色体G显带检查，加大测序深度可继续提高检测分辨率；③当前条件下，25 bp和109检测成本低于1000美元，但将来随着测序成本降低会达到微阵列比较基因组杂交接近的价格；④另外，作者认为该技术也可用于其他混合DNA样本的检测，如癌症患者血浆游离DNA中的CNV检测。