许珊，苏春利，冯亮，王焰新

中国地质大学(武汉) 环境学院 生物地质与环境地质国家重点实验室，武汉430074

长时期饮用高砷污染水，可引起包含皮肤损伤以及多个器官出现癌变的慢性中毒疾病[1]。目前，砷中毒已成为全人类共同面对的世界性难题，正威胁着至少22 个国家和地区5 000 万人口的健康[2]。其中，以孟加拉、印度和中国最为严重[3]。砷中毒严重威胁着广大高砷地下水分布区数百万人群的生命，危害当地居民身体健康，成为我国广大农村面临的严重公共卫生问题。

近年来，自然界中与砷代谢有关的微生物及其在地下水砷污染形成过程中的重要作用成为新的研究热点。研究显示，自然界中，砷代谢微生物广泛参与了砷的生物地球化学循环，不但影响着现在环境中砷的地球化学行为，而且对早期地球环境的形成也具有一定作用。越来越多的证据表明，微生物对砷的迁移具有一定影响，如微生物活动促进蓄水层中的砷从固相转化为液相[4]。另外，细菌对砷的氧化还原作用以及吸附-解吸作用在地下水中的砷迁移过程中起着关键作用[4-9]。在天然环境中，微生物-有机体对As(III)氧化和As(V)还原的速率也具有很大影响，其作用可能是非生物条件的几个数量级。一些天然有机物可将As(V)还原为As(Ⅲ)，还有一些可将As(Ⅲ)氧化为As(V)[10]。某些微生物在自然界中可长期与砷共存，并形成了不同的生物转化机制，包括As(V)和As(III)之间的氧化还原作用和砷的甲基化[4]。

国内外研究主要是利用富集培养、PCR 和克隆测序从不同环境中分离研究耐砷菌，对分离菌株生长条件因素(包括环境要求、营养配置要求和生长状况特性要求等)进行更深入研究并探讨其氧化或还原的特性。目前已从不同环境，包括矿山、土壤和沉积物、水相、盐湖等环境中分离出了与砷行为相关的耐砷菌[11-14]，如Campos 等[15]从岩石中分离出耐砷菌，通过氧化还原实验证明微生物在砷和类金属固定过程中作用明显。Drewniak 等[16]通过氧化/还原实验发现微生物群落结构对砷污染地下水有显著影响，并通过扩增出亚砷酸盐氧化基因和异化砷还原基因进一步强化氧化或还原菌作用，同时也证明微生物也可利用其他化合物参与环境中砷的地球化学行为。

大同盆地是典型的高砷地下水区域，砷的浓度变化范围为0.6 ～1 820 μg·L-1[17]。目前，对砷的行为研究大多是从水文地球化学方面探讨高砷地下水的分布、赋存环境、砷的来源及形成机制[18-19]，而对富砷含水层沉积物中耐砷菌的分离研究较少。Duan 等[20]利用大同盆地沉积物中分离出的菌株进行微生物实验发现，微生物作用下地下水中的砷浓度明显高于非生物作用下的砷浓度。Xie 等[21]从盆地高砷含水层中分离出一株具砷抗性和富集能力的Bacillus cercus菌，发现微生物活动会促进沉积物中的砷地下水释放。总体来看，对大同盆地高砷地下水环境中微生物的群落结构特征和优势种群的分布还缺乏深入研究，尤其是水相中微生物研究还没有系统的开展。本文采用稀释培养法研究了外加砷源对地下水中微生物数量的影响，同时基于生物学可培养方法，从高砷水样中分离出耐砷菌，利用RDP(Ribosomal Database Project)数据库对可培养菌进行细菌分类以及16S rDNA 序列比对方法鉴定其种属，为高砷地下水的生物修复找到关键菌株提供有效的信息。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 研究区概况

大同盆地是山西地堑系统的新生代断陷盆地之一[22]，面积达6 000 km2，是典型的位于干旱-半干旱区的第4 系沉积盆地。年均降雨量225 mm 至400 mm，且主要集中在7—8 月份，平均蒸发量在2 000 mm 以上。

盆地周围基石主要分布在盆地北部，西部和东部。北部出露有太古宙片麻岩和玄武岩，西部出露有寒武-奥陶系灰岩和石炭-二叠-侏罗纪砂岩、页岩，东北部零星分布有太古宙片麻岩和花岗岩[23]。盆地形成在古近纪以后，从山前倾斜平原到盆地中心沉积了厚度不等的第4 系松散岩类。桑干河是该盆地主干河流，发源于盆地西南宁武县的管涔山，由西南向东北贯穿整个盆地。高砷地下水呈条带状分布于盆地中南部，从朔州市东部穿越山阴县至应县，在宽约6 km，长约90 km 的范围内形成地下水砷富集带[22]，纵向上主要分布在15 ～60 m 深的范围内。水化学类型以Na-HCO3型为主，pH 值呈弱碱性。部分饮用井水呈淡黄绿色，含有H2S 或CH4气体，指示了该区典型的还原性地下水环境。

1.2 样品采集与分析

2012 年7 月至9 月在盆地中部山阴县古城、芦岭村、王庄、前射躲和双寨饮用水井中分别采集地下水样SHY-12-1、SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5 和DB12086，从小疙瘩村采集水样C1-1 和D1-3。水样SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5 以及D1-3 主要用于研究外加砷源对微生物数量的影响。水样DB12086、C1-1 以及SHY-12-1 用于分离培养耐砷菌。采样所用的水样容器为500 mL 的聚乙烯瓶。取样瓶在采样前先用蒸馏水清洗，再在采样时用预采水样润洗3 次。水温、pH 及电导率等水质参数在现场进行测定，碱度采用滴定法在24 h 内测定，一个子样用0.45 μm 滤膜过滤后加入HNO3保存，采用IRIS INTRE ⅡXSP 型ICP-AES(美国Thermo Electron 公司)测定金属元素，另一个子样采用DX-120 型离子色谱仪(美国DIONEX 公司)进行测定。元素As 含量采用AFS-2202 型双道原子荧光光度计(北京吉天有限公司)进行测定。剩余的子样送回实验室后，一个子样用无菌的0.22 μm 孔径膜过滤用于提取总DNA 和富集培养，另一个用于稀释培养。

1.3 稀释培养

分别取10 μL SHY-12-3、SHY-12-4、SHY-12-5、D1-3 水样至90 μL 无菌水中混匀。然后，取100 μL混合液至含0、375、3 750、11 250 和37 500 μg·L-1As(III)的LB 固体培养基平板上涂抹均匀。每次涂抹时需先将涂布棒灼烧灭菌，将涂抹好的平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养，直至长出菌落之后进行计数。同样取100 μL 水样，涂布于含0、375、3 750、11 250 和37 500 μg·L-1As(III)的LB 固体培养基，每个样重复3 次。

1.4 耐砷菌分离

C1-1 和SHY-12-1 样品采集送回实验室后，立即用无菌的0.22 μm 孔径膜过滤，将过滤膜含微生物的一面朝下放入150 mg·L-1As(III)的耐砷固体培养基上。培养基配方:每升双蒸水中含2.0 g NH4NO3、2.0 g 无水乙酸钠、0.5 g 酵母提取物、1.0 g胰蛋白胨、0.2 g 葡萄糖和15 g 琼脂，pH 值7.5，灭菌后加入无菌NaAsO2至As(III)终浓度150 mg·L-1，37℃避光培养。然后将长出来菌落根据形态上不同的克隆子再次划线培养后，再根据克隆子颜色，大小，形状，细胞形态和基本细胞壁性能(革兰氏染色)的差异挑选有代表性的菌株。

DB12086 样品采集送回实验室后，立即用无菌的0.22 μm 孔径膜过滤，将过滤膜含微生物的一面朝下放入含37 500 μg·L-1As(III)的LB 固体培养基上。培养基配方:每升双蒸水中含10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母粉、10 g 氯化钠和15 g 琼脂粉，pH 值7.5，灭菌后加入无菌NaAsO2至As(III)终浓度37 500 μg·L-1，37℃避光培养。然后将长出来菌落根据形态上不同的克隆子再次划线培养后，再根据克隆子颜色，大小，形状，细胞形态的差异挑选有代表性的菌株。

1.5 耐砷菌的鉴定及系统发育树构建

挑选出的单菌落根据微生物PCR 直接裂解缓冲液(Lysis Buffer for microorganism to Direct PCR，Takara)试剂说明书方法经裂解、PCR 扩增、电泳鉴定后，将PCR 产物进行测序。RDP 数据库进行细菌分类分析(http://rdp.cme.msu.edu/)，得到群落结构大致分类结果。用NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blast 搜索所得序列的同源性序列，进一步确定细菌种类，用Mega 4.0 采用邻接法(neighbor-joinin,N-J)对细菌群落构建系统进化树。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 水化学特征

7 个地下水样的温度变化范围为9.0 ～12.3℃，pH 值为7.43 ～8.80，呈弱碱性，总溶解固体(TDS)含量为564.7 ～4 843 mg·L-1，属Na-HCO3型微咸水。As 含量变化范围为7.25 ～528 μg·L-1，除了样品SHY-12-4 砷含量较低外，其余6 个水样均超过了世界卫生组织规定的饮用水标准上限(10 μg·L-1)，具体水化学成分见表1。其中，砷含量极高的水样DB12086、D1-3、SHY-12-1 的氧化还原电位(ORP)均为较高的负值，表明高砷地下水处于较强的还原环境。

2.2 外加砷源对不同类型微生物数量的影响

不同外加NaAsO2浓度下微生物计数结果见图1。由图可知，随着外加砷源浓度不断升高，地下水中微生物量呈现一个波动的变化过程，初始加入外加砷源为375 μg·L-1As(III)时，微生物数量都明显减少，推测该现象的原因是As 对大部分微生物生长不利，使培养基中不适应条件的微生物大量死亡。但当As 浓度达到3 750 μg·L-1时，培养基中微生物数量均出现小幅度回升，表明低浓度的砷对微生物生长可能具有刺激作用。当加入外加砷源浓度达到11 250 μg·L-1时，所有样品的微生物量都有降低。当外加砷源浓度达到37 500 μg·L-1时，样品SHY-12-3 的微生物量继续降低，D1-3 出现微生物量急剧减少现象，而SHY-12-4 和SHY-12-5 样中微生物量则回升。推测可能是因为砷对微生物有两种效应:一是不适应砷的微生物类群数量的减少，二是耐砷微生物的数量增大。D1-3 土著微生物处于强还原环境，生存的主要是厌氧菌，只有少量兼性厌氧菌，因此有氧培养时，厌氧菌死亡，而只有少量兼性厌氧菌生存。当低浓度NaAsO2培养时适应砷的微生物数量增加，但外加砷浓度高达37 500 μg·L-1As(III)时，已超过微生物原位环境的砷浓度(497.50 μg·L-1)近75 倍，大量兼性菌死亡。处于氧化环境的SHY-12-4、SHY-12-5 中生存的微生物主要是氧化菌，高浓度砷条件下生存物种可能比较单一，但砷很可能成为了某些抗砷菌生长所必需的元素，因而微生物数量会有增加，但相对未加NaAsO2的空白培养基，添加砷源条件下微生物数量还是有所减少。由此推测，总体上砷对环境中微生物生长具有一定的抑制作用，影响程度受水化学环境和水化学性质影响。

表1 大同盆地高砷地下水的水化学特征Table 1 Hydrochemical characteristics of arsenic-rich groundwater from Datong Basin

图1 不同砷浓度培养条件下水中微生物的数量Fig.1 Microorganism population in aqueous medium with different arsenic concentrations

熊如意[24]的研究表明，土壤中的砷会对自养微生物形成抑制和毒害作用，低浓度砷对异养微生物有刺激生长作用，高浓度砷对异养微生物有抑制作用，并且外加砷源对微生物生态的影响也很明显，与本研究结果比较符合。本实验中添加的砷源是毒性较大的NaAsO2，效果比较明显，具有一定借鉴意义。砷对微生物数量的影响，必然会导致其对种群结构的影响，微生物种类不同其功能也有不同，因而会直接影响到各种微生物不同功能的发挥以及其相互作用，从而对有机物的分解利用，营养元素循环等作用产生影响，最终对砷的循环迁移产生影响。

2.3 耐砷菌的群落结构特征

由RDP 分析及Blast 分析得到高砷地下水中可培养细菌组成如图2 所示。地下水中分离菌株鉴定及16S rDNA 基因系统发育图见图3。

图2 大同盆地高砷地下水中可培养细菌的组成注:DB12086 样品分离菌的耐砷浓度为37 500 μg·L-1，C1-1 和SHY-12-1 样品分离菌的耐砷浓度为150 mg·L-1。Fig.2 Compositions of the cultivable bacteria from high arsenic groundwater in Datong Basin

从水样DB12086 中分离出耐高浓度砷(37 500 μg·L-1)的菌株共45 株，分属4 种不同目:假单胞菌目(Pseudomonadales 87%)、气单胞菌目(Aeromonadales 7%)、芽孢杆菌目(Bacillales 4%)和未分类杆菌纲(unclassified Bacilli 2%)，其中部分可细分到假单胞菌属(Pseudomonas 39 株)以及气单胞菌属(Aeromonas 3 株)。可见从此点分离出大部分菌株属于革兰氏阴性的异养的变形菌门(Proteobacteria)，且主要是γ-Proteobacteria。从C1-1 号样品分离出耐150 mg·L-1砷浓度的菌株共有11 株，分属芽孢杆菌属(Bacillus 64%)、假单胞菌属(Pseudomonas 9%)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus 27%)。从SHY-12-1 号样品分离出9 株菌，其中大部分是芽孢杆菌属Bacillus(6 株)，另外的则属肠杆菌属(Enterobacter)。这两个地方都分离出芽孢杆菌(Bacillus)，此类菌属革兰氏阳性菌，在环境中广泛存在，能够形成芽孢，具有很强的抵抗逆境能力，在干燥状态下可生存数十年。不过微生物活性、存在及其生长会受到如温度、pH、氧化还原电位等水化学因素的影响，因而不同深度含水层和不同成因的地下水中细菌的数量和种类会有差别。Fan 等[25]研究发现砷氧化菌主要分布在沉积物浅表层，而砷还原菌主要分布在沉积物中深层。本实验3 个点地下水温度适中、pH 呈弱碱性，适合大部分地下水中的微生物生长。3 个地下水样的As 浓度都偏高，对大部分微生物生长可能都是不利的，生存物种可能比较单一，但也会使得微生物在这一独特的极端环境中经过长期的变异与进化产生抗砷的特性。原位水处于氧化环境、砷浓度为104 μg·L-1的C1-1 与原位水处于还原环境、砷浓度高达528 μg·L-1的SHY-12-1 相比，从C1-1 分离出特有属是Pseudomonas 和Paenibacillus，这类微生物大部分是需氧菌，从SHY-12-1 分离出特有属是兼性厌氧的Enterobacter，是一类γ-Proteobacteria 细菌。DB12086 可培养微生物种类主要是Pseudomonas，也是一类γ-Proteobacteria菌，与同样还原条件的SHY-12-1 比较，Enterobacter 耐As(III) 性较Pseudomonas 可能更强。Taylor 等[26]研究发现环境主要耐砷微生物属于γ-Proteobacteria 和δ-Proteobacteria，本研究结果也进一步证实，大同盆地高砷地下水中γ-Proteobacteria 细菌是环境中主要耐砷微生物。

由图3 知，从DB12086 号样品分离出的菌株DB12086-1 等 属 Pseudomonas。与 从 冰 川(JX949976.1)、烟叶草(FJ815158.1)和阿尔塔米拉(Altamira)洞穴(FJ790133)环境中分离出的菌株相似性最高。Pseudomonas 代谢多样，在自然界甚至是一些极端环境条件下也广泛分布，因而在研究区地下水环境中发现此类菌存在并不奇怪。FJ790133 菌株在15℃培养时可使培养基中的pH 值从7.0 升到9.3[27],而pH 值的增大会使胶体和粘土矿物表面带更多的负电荷,从而降低对以阴离子形式存在的砷酸和亚砷酸的吸附，这是造成砷浓度增大的一个重要因素[23]。因此可推测分离出的菌株Pseudomonas可能通过改变地下水的水化学特征(如使pH 值升高)，从而促进高砷地下水的形成。分离出的DB12086-27 菌株与从水源、土壤以及人的粪便都已分离出的Aeromonas 相似性达99%，Anderson等[28]从新西兰(New Zealand)尾矿中就分离到一株Aeromonas sp.CA1 菌株，该菌可通过一种迄今未报道的机制将砷酸盐还原为亚砷酸盐，同时发现pH值的升高能延长分离菌的生长周期。Wang 等[29]从水稻土壤中分离出可还原Fe(Ⅲ)的Aeromonas，说明还原菌株具有较强的还原Fe 的能力。本研究结果与这些研究者从其他环境中分离出的耐砷菌株的结果是相符，如Pepi 等[30]从砷污染的奥巴蒂罗市(Orbetello)泻湖的沉积物中分离到的耐砷菌株主要是Aeromonas、Bacillus 和Pseudomonas。

C1-1 号样品分离出的菌株大部分都是Bacillus，C1-1-4 菌株与从植物根部分离出的Paenibacillus(GU328691.1)的相似性最高，研究发现GU328691.1 菌具有固氮作用，可将大气中的氮还原为氨，可能会使环境呈还原状态而有助于高砷水形成。从SHY-12-1 号样品中分离出的菌株不仅包括Bacillus，还包括兼性厌氧、容易在普通培养基上生长的Enterbacter，与Chitpirom 等[31]从皮革废料和农业土壤中分离出耐砷酸和亚砷酸的菌株Enterobacter 相符。

尽管3 个水样的环境条件差异较大，但3 个点中，DB12086 号样品中分离出Bacillales，其余2 点都分离出了Bacillus 菌，说明环境中可培养细菌主要是Bacillales，这与之前大部分研究结果很符合。过滤膜后在不同浓度砷的普通培养基上培养，耐高浓度(150 mg·L-1)NaAsO2的主要是Enterbacter，而耐较低浓度(37 500 μg·L-1)的主要是 Pseudomonas，这个结果说明Enterbacter 可能对高砷地下水更适应，对环境中砷迁移作用影响可能会更大。16S rDNA 基因序列分析能快速地对微生物进行分类、鉴定。但由于实验中未研究分离菌对砷的氧化或还原特性，因而只能初步确定其为耐砷菌，还不能确定其氧化还原性。

图3 大同盆地高砷地下水中分离菌株的16S rDNA 基因系统进化树注:采用邻接法(N-J)法;括号内为登录号，节点只显示＞50%的引导值。Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of culturable bacteria from high`arsenic groundwater in Datong Basin

综上，通过添加外加砷源、稀释培养法发现外加砷源对大同盆地高砷地下水中微生物数量有影响，表现低浓度(375 μg·L-1)的砷对微生物生长可能具有刺激作用，但是高浓度(37 500 μg·L-1)的砷则对大部分微生物生长呈现抑制作用。砷对微生物的数量产生影响，很可能同时会影响微生物的群落结构及其功能，进而影响微生物对有机物降解和营养元素吸收等作用，最终对砷的迁移和转化等行为产生影响，因此微生物与外源砷之间是相互作用关系。

通过富集培养从高砷地下水中筛选出的耐高浓度NaAsO2的菌株，经RDP 和16S rDNA 分析鉴定后发现，大同盆地地下水环境中可培养耐砷菌主要有Bacillus、Pseudomonas、Paenibacillus、Aeromonas和Enterobacter。不同砷含量地下水环境中可培养耐砷菌组成不同，但都可分离到生存能力强的Bacillales。主要的耐砷菌是γ-Proteobacteria，这类微生物很可能通过改变地下水中水化条件(如pH值)而促进高砷地下水的形成。根据培养基中NaAsO2浓度的不同，耐高浓度(150 mg·L-1)砷的主要是Enterbacter，而耐较低浓度(37 500 μg·L-1)的则主要是Pseudomonas。

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