陕西省榆林市第二医院（榆林719000） 高不为

糖皮质激素是一种在临床上应用广泛的激素，可广泛用于炎症、风湿及器官移植后产生的排斥反应［1，2］。但大剂量长期使用糖皮质激素，会产生明显的不良反应。特别是对骨骼产生的影响，最严重时会造成糖皮质激素性骨质疏松，导致发生病理性骨折的危险大增［3］。目前研究骨质疏松的作用机制已经深入到细胞和分子水平，仍然有很多问题需继续深入研究。实验证明不同剂量的地塞米松在体外对骨骼产生的影响不同［4］。门冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶（Caspases）存在于胞质溶胶中，是一组结构相关半胱氨酸蛋白酶，对介导细胞凋亡的过程有非常重要的作用。Caspase－3是Caspase家族成员中研究最多的一种半胱氨酸蛋白酶，功能相对明确，其活化的程度反映了凋亡发生的强弱［5，6］。本组观察应用不同剂量地塞米松对大鼠骨生物指标、成骨细胞调亡及Caspase－3表达产生的影响，初步探讨地塞米松对实验动物骨代谢的影响机制，从而为提出相关预防措施提供理论依据。

材料与方法

1 动物与分组 将3月龄的雌性SD大鼠40只随机分为四组：对照组（10只），地塞米松（美国内布拉斯加大学药学院）低剂量组（1mg／kg，10只），地塞米松中剂量组（2．5mg／kg，10只），地塞米松高剂量组（5 mg／kg，10只），尾静脉注射，2次／周。连续给药8周，在动物处死前前3天或者前4天颈部皮下注射钙黄绿素（美国Sigma公司）进行体内双荧光标记。饲养室温24～28℃，湿度50%～60%，分笼饲养。

2 骨生物指标测定 取四组大鼠的第5腰椎（L5）与第3腰椎（L3），剔除周围组织与肌肉，生理盐水冲洗后用锡纸包裹，装代－20℃冻存，L3进行骨矿含量测定；L5剪去腰椎椎弓打磨后，进行压缩力学实验，检测最大载荷值。

3 成骨细胞培养 四组大鼠引颈法处死后，75%酒精浸泡消毒10min。将腰椎骨剪成大小约1mm2的小块，加入0．25%胰蛋白酶消化约15min；终止消化3d后换液，7～10d后待细胞铺满瓶底约80%后再传代培养。

4 细胞凋亡检测与Caspase－3活性检测 将成骨细胞接种于6孔培养板，6孔培养板中放置有无菌盖玻片，使细胞贴壁生长，分别加入含不同浓度药物的培养基，分别于24h、48h、72h每组随机选取3个样本，进行荧光染色，以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察计数；每个样本随机选取三个视野计数总细胞数和凋亡细胞数，算出凋亡率（凋亡率＝凋亡细胞／细胞总数X100%），样本凋亡率取三个视野凋亡率的平均值。同时用Caspase－3分光光度法检测试剂盒检测 Caspase－3活性。

5 统计学处理 本组结果统计数据以SPSS18．0软件分析，骨生物指标以及成骨细胞调亡及Caspase－3表达数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0．05为有显著性差异，P＜0．01为有极显著性差异。

结 果

1 腰椎骨矿含量与最大压缩载荷的对比 见表1。随着地塞米松浓度的增加，骨矿含量逐渐降低，但组间无显著性差异（P＞0．05），而地塞米松低剂量组的最大压缩载荷明显少于其他三组（P＜0．05）。

2 凋亡率对比 见表2。经过观察，与对照组对比，地塞米松三组成骨细胞的凋亡率均明显增加（P＜0．05），低剂量组的凋亡率少于中剂量组与高剂量组（P＜0．05）。

3 不同组别成骨细胞Caspase－3活性对比 见表3。与对照组对比，地塞米松三组成骨细胞的Caspase－3活性均明显增加（P＜0．05），低剂量组的Caspase－3活性少于中剂量组与高剂量组（P＜0．05）。

表1 不同组别的腰椎骨矿含量与最大压缩载荷的对比（±s）

表1 不同组别的腰椎骨矿含量与最大压缩载荷的对比（±s）

组 别 骨矿含量（g） 最大压缩载荷（N）对照组 0．12±0．01 214±30地塞米松低剂量组 0．11±0．02 179±51中剂量组 0．09±0．02 204±21高剂量组 0．08±0．03 209±53 F 值 0．962 3．621 P 值 0．088 0．018

表2 不同组别对成骨细胞凋亡率的影响（%，±s）

表2 不同组别对成骨细胞凋亡率的影响（%，±s）

组 别不同处理时间的凋亡率24h 48h 72h对照组 0．78±0．12 0．79±0．12 0．79±0．12低剂量组 1．75±0．84 2．27±1．13 2．39±1．32中剂量组 2．00±0．20 6．75±0．25 7．08±0．56高剂量组 2．88±0．20 7．27±1．13 7．39±0．52 F 值 12．658 18．965 14．328 P 值 0．000 0．000 0．000

表3 不同组别对成骨细胞Caspase－3活性的影响（±s）

表3 不同组别对成骨细胞Caspase－3活性的影响（±s）

组 别不同处理时间的Caspase－3活性24h 48h 72h对照组 0．09±．01 0．09±0．01 0．10±0．01低剂量组 0．12±0．02 0．20±0．01 0．18±0．01中剂量组 0．16±0．03 0．26±0．06 0．27±0．01高剂量组 0．19±0．03 0．29±0．02 0．30±0．02 F 值 6．215 10．009 12．526 P 值 0．003 0．000 0．000

讨 论

当前虽然在临床上地塞米松的使用越来越多，但是对于骨质疏松的影响也越来越大。近年的研究发现，使用地塞米松4周的小鼠成骨细胞凋亡增加3倍，28%的皮质骨干骺端骨细胞凋亡［7］。另外地塞米松性骨质疏松患者成骨细胞和破骨细胞凋亡均有增加［8］。另外还有学者证实了地塞米松能够诱导原代分离培养的成骨细胞发生凋亡，而且这种效应呈药物浓度和时间依赖性［9］。

我们知道，骨质量的好坏决定于骨量的多少、骨组织的功能这两个方面的合理构成，腰椎骨矿含量与最大压缩载荷能较好地反映骨骼的内在力学性能。因此，能直观观察并定量分析腰椎骨矿含量与最大压缩载荷，再结合反应骨强度的生物力学实验能够更好地分析和评价骨质量的状态［10］。本组结果显示：随着地塞米松浓度的增加，骨矿含量逐渐降低，而地塞米松低剂量组的最大压缩载荷明显少于其他三组。说明不同剂量的地塞米松显著抑制骨形成，并且有剂量依赖性。虽然腰椎骨量不减，骨力学性能改变不大。

骨骼生长、更新和修复过程包括成骨细胞主导的骨形成过程以及破骨细胞调节的骨吸收过程［11］。正常情况下，骨骼系统中骨形成和骨吸收之间处于动态平衡，许多疾病的发生，就是由于失去了这种动态平衡，而出现骨吸收速度超过骨形成速度所致，导致骨细胞数量减少［12，13］。证实激素的作用主要是诱发成骨细胞和骨细胞凋亡，骨组织生成减少，更新率降低，凋亡持续发展，引起股骨头坏死。本组观察到地塞米松三种剂量组成骨细胞的凋亡率均明显增加，低剂量组的凋亡率少于中剂量组与高剂量组，证实了地塞米松能够诱导原代分离培养的成骨样细胞发生凋亡，而且这种效应呈药物浓度和时间依赖性。同时本研究也观察到地塞米松三组成骨细胞的Caspase－3活性均明显增加，低剂量组的Caspase－3活性少于中剂量组与高剂量组。说明地塞米松可以通过激活Caspase－3而引起成骨细胞的凋亡，即Caspase－3在地塞米松诱导的成骨细胞凋亡中扮演重要角色。

总之，地塞米松的应用能降低骨生物学质量，诱导成骨细胞凋亡，Caspase－激活是一条主要途径，而小剂量的应用对于这种影响比较小。

［1］ 刘 竞，李 昕，桂 嵘，等．地PDCD5蛋白对地塞米松诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制初探［J］．中南大学学报，2010，35（7）：725－731．

［2］ 郭振刚，李 刚．股骨头坏死的药物研究进展［J］．山西中医，2009，24（6）：58－60．

［3］ Wood WG，Eckert GP，Igbavboa U，Müller WE．Statins and neuroprotection：aprescription to move the field forward［J］．Ann N Y Acad Sci，2010，1199（1）：69–76．

［4］ 唐 磊，张元和．骨形态发生蛋白在股骨头坏死治疗中的应用［J］．中国组织工程研究与临床康复，2010，14（46）：8665－8668．

［5］ Ruiz－Gaspa S，Nogues X，Enjuanes A，et al．Simvastatin and atorvastatin enhance gene expression of collagen type I and osteocalcin in primary human osteoblasts and MG－63cultures［J］．J Cell Bioeheln，2007，101（46）：1430－1438．

［6］ Liu M，Wang K，Tang T，et al．The effect of simvastatin on the differentiation of marrow stromal cells from aging rats［J］．Pharmazie，2009，64（1）：43－48．

［7］ Xu J，Liu XF，Chen JL，et al．Simvastatin enhances bone marrow stromal cell differentiation into endothelial cells via notch signaling pathway［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2009，296（3）：535–543．

［8］ Woolf AD．An update OH glucocorticoid induced osteoporosis［J］．Curr Opin Rheumatol，2007，19（4）：370－375．

［9］ Ogoshi T，Hagino H，Fukata S，et al．Influence of glucocorticoid on bone in 3，6，and 12month old rats as determined by bone mass and histomorphometry［J］．Mod Rheumatol，2008，18（6）：552－561．

［10］ 庞金辉，黄煌渊，张 权，等．不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响［J］．创伤外科杂志，2009，11（3）：248－252．

［11］ Shimizu H，Arima H，Watanabe M，et al．Glucocorticoids increase neuropeptide and agouti related peptide gene expression via adenosine monophosphate activated protein kinase signaling in the arcuate nucleus of rats［J］．Endocrinology，2008，149（9）：4544－4553．

［12］ 吴礼杨，贝抗胜．骨形成蛋白信号转导及调控［J］．中国组织工程研究，2012，16（2）：331－335．