杨磊磊，戴岳楚，董米连，朱 敏，林雪飞，廖 伟，梅 统

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一［1］，为研究大肠癌的发生发展的机制，国外已经建立了大肠癌细胞株，细胞株经过长期培养后，生物学特性会产生变异。而原代培养的细胞离体时间短，则与体内状态更相近，能很好地反映患者的疾病特征。关于大肠癌细胞原代培养方法国内外已有较多的报道，但成功率很低［2］。2010年3月—2010年11月我们对60例大肠癌患者的肿瘤细胞进行原代培养，并对不同的培养方法加以改进。

1 材料与方法

1.1 标本 标本来自手术治疗的60例大肠癌患者（男33例，女27例；年龄20～84岁），术前均未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗。

1.2 主要试剂 胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、转铁蛋白（Sigma）、肿瘤细胞分离液、1640培养液、胎牛血清、0.14％台盼蓝染液（Sigma公司）、Giemsa染液、免疫细胞化学相关试剂。细胞原代培养主要试剂的配制见表1。

1.3 标本采集与处理 采用了两种取材方法：（1）黏膜层法。打开肠腔，找到癌灶，冰冷生理盐水冲洗干净，找到癌细胞最丰富的部位。根据肿瘤大小切取1.5～2.5cm3大小的肿瘤组织，修剪并去除坏死组织及脂肪组织。聚维酮碘溶液浸泡2～3min，洗液A反复冲洗。（2）浆膜层法。不打开肠腔，聚维酮碘消毒，打开浆膜层、肌层，找到肿瘤细胞最丰富的部位取材，洗液A反复冲洗。将组织块表面薄层剔除。

表1 细胞原代培养主要试剂的配制

1.4 大肠癌细胞分离与培养 组织块法：（1）将组织块切碎（0.5～1mm3），洗液B反复吹打，使碎块充分分散。（2）移入15mL无菌离心管中。（3）1000r离心2min，移除上清液。（4）洗液B重悬，重复步骤（3）2次。（5）用吸管将组织碎块移入25cm2预先用L-左旋多聚赖氨酸处理过的培养瓶中，加2mL预先配好的培养液，将培养瓶底朝上放入37℃含5％CO2的培养箱中2～4h，缓慢翻转培养瓶继续培养。（6）绝对静置12～24h，缓慢取出培养瓶补加培养液2mL，继续培养。绝对静置2d。（7）3d后小心取出培养瓶仔细观察并将漂浮的碎块去除，更换培养液继续培养。

机械分离法：（1）同组织块法的（1）～（4）。（2）将组织碎块移入不锈钢滤网中，研磨并收集研磨液于15mL无菌离心管中。（3）加入等体积的肿瘤细胞分离液。可见到分离液逐渐下沉，出现明显的分层，上层是研磨液，下层是肿瘤细胞分离液。（4）2000r离心10min，取出离心管，可见明显分层（3层）。收集中间层于另一个15mL无菌离心管中。（5）加入5～10mL洗液B，1000r离心5min，移除上清液。（6）用洗液B重悬，重复步骤（5）1次。（7）加入5mL培养液重悬。（8）将悬液移入25cm2预先用L-左旋多聚赖氨酸处理过的培养瓶中，将培养瓶放入CO2培养箱中继续培养。（9）绝对静置24～48h，缓慢取出培养瓶观察培养液颜色，判断是否需要补加培养液，继续培养。

胰蛋白酶消化法：（1）同组织块法的（1）～（4）。（2）将组织碎块移入15mL无菌离心管中。加入3～5mL胰蛋白酶消化液，放入37℃恒温振荡箱中，不断振荡，每隔15min观察1次，30min后每隔15min收集消化液。（3）1000r离心2min，移除上清液，收集细胞沉淀，用洗液A冲洗。（4）将收集的细胞沉淀用培养液重悬，置于4℃冰箱中，直至消化过程全部结束（组织碎块充分弥散开为止）。（5）将细胞悬液通过无菌的不锈钢滤网，收集滤液于15mL无菌离心管中。（6）同机械分离法（3）～⑼。

Ⅳ胶原酶消化法∶（1）同组织块法的（1）～（4）。（2）将组织碎块移入15mL无菌离心管中。加入3～5mLⅣ胶原酶消化液，放入37℃恒温振荡箱中，不断振荡，每隔20min观察1次。直至消化过程全部结束（组织碎块充分弥散开为止）。（3）将消化液连同组织碎块一起移入不锈钢滤网，收集滤液于15mL无菌离心管中。（4）同机械分离法（3）～⑼。

1.5 细胞成活率检查 采用台盼蓝染料排斥实验，其原理为活细胞能排斥染料，但细胞膜完整性破坏后，染料可弥散入细胞内。取纯化后的细胞悬液50μL加入等体积0.14％台盼蓝充分混匀。5min内进行细胞计数及活性鉴定，死细胞着蓝色，活细胞不着色。

1.6 传代方法 每天观察细胞的生长情况，每3d更新培养液，待细胞覆盖瓶底70％～90％时可进行传代。（1）去除培养液，PBS洗两次，加入含0.2％EDTA的0.1％的胰蛋白酶2mL。（3）见到部分细胞变圆并开始脱落，每隔2min收集脱落细胞于15mL离心管中，并向离心管中加入等体积培养液终止消化。（4）每次收集细胞后重新向培养瓶补加0.1％的胰蛋白酶1mL继续消化，直至消化过程全部结束。（5）1000r离心5min，移除上清液。（6）加入10mL培养液重悬。吸取5mL分别移入2个25cm2预先用L-左旋多聚赖氨酸处理过的培养瓶中，即为P1代。（7）将培养瓶放入37℃含5％CO2的培养箱中继续培养。

1.7 大肠癌原代细胞的鉴定 细胞形态观察，用瑞吉染色法染色并观察细胞形态。细胞免疫学鉴定，用免疫细胞化学法分别检测细胞角蛋白（cytokeratins，CK）及癌胚抗原CEA。

1.8 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析，计数资料结果分析采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞分离培养方法比较 如表2所示，黏膜层取材组优于浆膜层取材组（P＜0.05）。胶原酶消化法优于胰酶消化法（P＜0.05），胰酶消化法优于机械分离法（P＜0.05），机械分离法与组织块法差异无统计学意义（P＞0.05）。其中胶原酶消化法是最优的人类大肠癌细胞原代培养方法，细胞培养成功率达到66.7％。取材方法与分离培养方法对细胞培养成功率都有影响（P＜0.05）。

表2 大肠癌细胞分离培养方法的比较（n=60）

2.2 细胞培养结果及鉴定结果 细胞培养结果详见图1～图5。瑞吉染色法，细胞核被染成紫红色，细胞浆被染成蓝色，细胞核大深染，核质比增大（图6）。免疫细胞化学检测细胞角蛋白，细胞的胞浆被染成棕黄色，而阴性及空白对照则仅见胞核为苏木素复染呈蓝色，胞浆阴性（图7）。癌胚抗原CEA检测结果与相应患者组织标本免疫组化鉴定结果一致。

图1 大肠癌原代细胞培养第1代

图2 大肠癌原代细胞培第2代

图3 大肠癌原代细胞培养第3代

图4 大肠癌原代细胞培养第10代

图5 大肠癌原代细胞培养第20代

图6 大肠癌细胞原代培养第10d瑞吉染色

图7 大肠癌细胞原代培养第10d细胞免疫化学检测细胞角蛋白200×

3 讨论

肿瘤细胞原代培养程序复杂，细胞生长受到温度、营养物质、酸碱度等多种因素的显著影响，细胞培养工作的各个环节都有严格的规定和要求。因此，要认真的摸索实验条件，总结经验，这样才能提高细胞培养的成功率。肿瘤细胞体外的成功培养关键在于肿瘤组织的选择、杂细胞的排除、适宜的生存环境等几个方面。由于大肠本身就是一个细菌生存的大容器，所以污染是大肠癌细胞培养中所必须克服的首要问题。因此我们主要从这几个方面来进行讨论。

3.1 大肠癌细胞分离培养方法的比较 胶原酶消化法适用较广，成功率最高；胰酶消化法成功率仅次于胶原酶消化法，会影响细胞贴壁效果，长期培养效果不佳；机械分离法对标本要求较高，机械分离作用易使细胞受损，细胞成活率较低；组织块法操作简单，成本低，细胞成活率较低。

3.2 控制污染措施 在控制污染方面，不但要求所用器材、试剂都保持无菌，严格按照无菌操作的原则进行操作。我们还着重从以下几个方面采取了进一步的控制污染措施：（1）术前清理肠道。（2）取材前清洁取材部位，冰冷生理盐水反复冲洗，聚维酮碘消毒。（3）取材方法的改进。我们用了两种取材方法，黏膜层法及浆膜层法。黏膜层法比浆膜层法直观，在直视下取到的肿瘤细胞更丰富。但是黏膜层法需要打开肠腔增加了污染的可能。浆膜层法可以降低污染的可能，却很难获得足够的肿瘤细胞。（4）取材后立刻用聚维酮碘浸泡2～5min。（5）分离过程中始终保持细胞在有抗生素的环境中进行。通过对抗生素的浓度进行对照研究，配制出了含不同抗生素浓度的洗液A、B以及消化液A、B。取得了良好的效果。（6）培养基中加入适量抗生素也可有效防止污染。通过对照研究配制出含抗生素的培养液。

3.3 肿瘤组织的选择 （1）挑选术前未经过任何放化疗的患者作为实验对象。（2）肿瘤组织足够大（＞2cm3），保证能够获得体积＞1cm3的组织。（3）在肿瘤细胞丰富的部位取材。（4）避开坏死区及脂肪组织较多的部位。（5）为了保证细胞成活率，还要注意取材要快。最好在肿瘤组织离体30min内开始实验。（6）为了防止肿瘤细胞发生自溶或凋亡，在成功接种肿瘤细胞前要保持肿瘤细胞始终在4℃的环境中。

3.4 杂细胞的排除 （1）取材前避开坏死及脂肪组织，取材后仔细修剪。（2）肿瘤细胞分离过程中加入肿瘤细胞分离液，可以获得较纯的肿瘤细胞。（3）成纤维细胞的清除。我们采用胰酶消化法来清除成纤维细胞，利用了不同细胞对胰酶的敏感性不同，成纤维细胞首先被消化下来，从而获得了较纯的肿瘤细胞。小鼠结肠上皮细胞在5％的血清浓度条件下生长良好，并且可在一定程度上抑制成纤维细胞的生长。在本实验中，发现大肠癌肿瘤细胞在5％的血清浓度条件下生长非常缓慢，而在20％的血清浓度条件下生长良好。（4）杂细胞清除时间的选择。国外许多学者的经验表明，当肿瘤组织块贴壁后，其癌细胞成片的生长，形成集落，常常抑制了杂细胞的生长，但也存在少量的杂细胞。根据这个结论，可以暂不对贴壁的细胞进行消化清除杂细胞，而是在第一次传代时进行。

3.5 培养条件 （1）为了促进细胞生长，我们对培养基进行了优化，在1640培养基中加入了可以促进细胞生长的胰岛素和转铁蛋白。小剂量的胰岛素可刺激细胞的生长，而过大则可能使细胞处于一种“饥饿状态”，反而抑制其生长。我们在培养液中加入了0.5μg/mL的胰岛素，细胞生长良好。（2）原代细胞培养贴壁比较困难，在分离获得分散细胞并接种后要保持培养瓶绝对静置2～3d，以免过早晃动导致细胞脱落。文献报道，有用小鼠胚胎肺成纤维细胞-3T3细胞作为滋养层提高细胞的接种效率，也有用自制鼠尾胶原铺制培养瓶来促进细胞贴壁。需要注意的是，在鼠尾胶原的制备过程中，由于鼠尾胶原为黏度较大的半透明液体，难以滤过除菌，整个制备过程需严格无菌，增加了污染的机会。我们采用了多聚赖氨酸包被培养瓶法及血清包被培养瓶法，收到了良好的效果，而且操作简单。还应注意，在用胰酶消化法分离培养细胞时，要分次消化收集消化下来的细胞，这样可以缩短细胞与胰酶直接接触的时间，减少胰酶对细胞的损伤，使贴壁更容易。同样在第一次传代时，由于原代细胞生长缓慢，第一次传代时往往细胞已经生长了2周左右，消化非常困难，也要注意用分次消化法，以免消化时间过长导致贴壁困难。

3.6 细胞分离培养方法比较 （1）组织块法方法简便、有效、成本低，但是杂细胞较多。组织块法需注意剪碎的组织块大小要适宜，如果过大，组织块边缘贴壁不良细胞溢出减少；如果过小，则因剪切过度而使细胞受损。在加液时一定要小心，以免冲散刚贴壁的组织块，导致重新漂浮，而影响成活。（2）机械分离法操作简单、成本也比较低，但是机械分离需要研磨组织，产生大量的细胞碎片影响正常细胞的生长。我们用了肿瘤细胞分离液去除了细胞碎片，但是研磨还导致大量的细胞受损，收集到的细胞活性很低，因此成功率很低（18.3％）。（3）胰酶消化法，取决于不同的细胞对胰酶消化的敏感性，关键是消化时间不易把握，时间过短获得的肿瘤细胞数量不够，时间过长影响细胞贴壁。成功率相对较高（41.7％）。（4）胶原酶消化法是细胞原代培养比较成功的方法，国外报道成功率在50％～60％［3］。我们在Simon P等［4］人方法的基础上进行了改进，建立了较为合理、高效、稳定的短期大肠癌细胞原代培养模式，即通过黏膜层取材，优化后的胶原酶消化法，使人类大肠癌细胞原代培养成功率提高到66.7％。

［1］Saunders M，Iveson T.Management of advanced colorectal cancer：state of the art［J］.Br J Cancer，2006，95（2）：131～138.

［2］Dangles-Marie V，Pocard M，Richon S，et al.Establishment of hu⁃man colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts：comparison of success rate and cell line features［J］.Cancer Res，2007，67（1）：398～407.

［3］Alessandra Failli1，Rita Consolini1.The challenge of culturing hu⁃man colorectal tumor cells：establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches［J］.Tu⁃mori，2009，95（3）：343-347.

［4］Simon P.Cancer cell culture：methods and protocols［M］.New Jer⁃sey Humana Press，2004：79-93.