高丽丽，余卫平

(东南大学医学院病理学与病理生理学系，江苏南京 210009)

SET7/9含有SET结构域，是蛋白赖氨酸甲基化转移酶 (proteinlysinemethyltransferases，PLMTs或PKMTs)家族成员。有报道称之为SET7，也有报道称之为SET9［1-2］。近年来发现SET7/9催化的非组蛋白甲基化作用能引起蛋白稳定性改变和基因表达变化等多种分子效应，涉及到染色体结构、细胞周期及凋亡等方面。因研究需要，我们建立了活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白)表达系统与纯化方法。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

本实验所需的大肠杆菌CM1061菌株、大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株、pCMV-SET7/9质粒均由本课题组保存;原核表达载体质粒pGEX-6P-3由Amersham Biosciences公司提供。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化、质粒提取试剂盒为QIAGEN公司产品;PCR酶、限制性内切酶购自 TaKaRa公司;T4 DNA连接酶由New England Biolabs公司提供;Glutathione Agarose吸附柱为Sigma公司产品;人组蛋白H3由 upstate公司提供;Adenosel-L-Methionine，S-K［methyl-3H］由PerkinElmer公司提供;Bio-Rad蛋白测定试剂盒由BIO-RAD公司提供;引物合成、测序均在INVITROGEN公司完成。

1.3 pGEX-SET7/9原核重组表达载体的构建

1.3.1 设计与合成寡聚核苷酸引物 目的基因为含SET结构区的SET7/9基因片段，位于pCMV-SET7/9全基因序列的第268～1 365个核苷酸。通过NCBI GenBank确定pCMV-SET7/9的cDNA序列，选择EcoRⅠ和XhoⅠ作为酶切位点，采用DNA Star软件设计SET7/9引物。SET7/9引物上游:5'-ACCGAATTCCAT GGATAGCGACGAC-3'，含EcoRⅠ酶切位点及启始密码子;SET7/9引物下游:5'-CTCCTCGAGTCATTACTTT TGCTGGGTGGCCTG-3'，含终止密码子及XhoⅠ酶切位点。

1.3.2 扩增目的基因 以pCMV-SET7/9质粒为模板，PCR扩增目的基因。等量去离子水代替模板作为阴性对照。其反应条件为94℃ 13 min热启动;94℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收，产物纯化后测序确认。

1.3.3 构建pGEX-SET7/9表达载体 将原核表达载体pGEX-6P-3转入大肠杆菌CM1061菌株。挑取单个菌落培养，大量提取质粒DNA。……