刘满杏，李 霞，刘荣堂，杨 慧，赵 丽，李 鹏

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097）

腹泻是一类危害人类健康的严重传染病，约50%的婴幼儿秋冬季腹泻是由轮状病毒引起的。轮状病毒是一种肠道病毒，属于呼肠病毒科轮状病毒属［1］，主要以粪-口途径传染，在人类手上能存活数小时，而在无生命表面能存活数天，并能抵抗一般消毒剂［2］。在发达国家和发展中国家轮状病毒的发病差别不大，不太可能通过改善环境卫生和营养状况使之降低［3］。轮状病毒二十面体，带有3层结构的衣壳蛋白，外层包括VP4和VP7［1］，内层是VP6，核心层是VP1、VP2和VP3。目前缺乏治疗性药物，口服补药是首选的治疗方法。VP7蛋白占病毒粒的30%［4］，是病毒的主要外壳糖蛋白，决定病毒的血清型，并可诱导中和抗体，是轮状病毒基因工程疫苗研究的首选。因为VP7基因是轮状病毒的一个亚基，因此不会对人体造成过度刺激，理论上不会产生致病反应。在转基因植物疫苗的生产和传输方面，植物作为生物反应器的潜力是巨大的，但是转基因植物目的抗原的表达量有待于进一步提高。到目前为止，已转化口服疫苗成功的植物有烟草（Nic-otianatabacum）、马铃薯（Solanumtuberosum）、番茄（Lycopersiconesculentum）、香蕉（Musaparadisiaca）、莴苣（Lactucasativa）、羽扇豆（Lupinus polyphyllus）、菠菜（Spinaciaoleracea）、玉米（Zea mays）、苜蓿（Medicagosativa）等。烟草易于转化和繁殖，但其组织中含有大量的生物碱。马铃薯也容易转化，但人们一般只吃熟马铃薯。利用可直接生食的植物是未来生产口服疫苗的必然趋势，胡萝卜（Daucuscarota）可生食，易运输，耐储存及蛋白含量高等优点使其不可避免地成为植物受体系统的理想选择［5］。

胡萝卜是一种两年生草本植物，伞形科胡萝卜属，其营养丰富，被称为健康的功能食品。转基因胡萝卜不管从营养上还是外形上都与正常胡萝卜差异不大。目前，有人利用转基因胡萝卜表达肺结核疫苗［6］，郑回勇等［7］将人乳铁蛋白基因转入胡萝卜，为其添加新的营养保健因子，同时对增强植株抗性具有重要意义。根据VP7-U基因在植物表达中的需求，优化部分VP7基因的密码子，期望能够增加VP7蛋白在植物中的表达量。本研究将VP7-U基因转化到胡萝卜中，检测VP7-U基因在转基因胡萝卜中的表达及其免疫原性。

1 材料与方法

1.1 材料VP7-U基因表达载体，由中国科学院微生物所构建；VP7-U胡萝卜种子和黑田五寸种子由中国农业科学院提供；BALB／c小鼠购自中国农科院动物中心。

Tag酶购自天根生化和全式金公司，反转录试剂盒购自promega和全式金公司，蛋白Maker购自MBI和天根生化公司，弗氏佐剂构自Sigma公司，羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP分别购自博士德公司和中杉金桥公司。小牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司，四甲基联苯胺（TMB）购自天根生化公司，二氨基联苯胺（DAB）购自天根生化公司。PCR引物由奥科生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 胡萝卜阳性植株的种植 种植VP7-U胡萝卜传代种子，对转基因胡萝卜植株进行传代，在胡萝卜植株10cm左右时，取新鲜胡萝卜叶子提取DNA进行PCR检测，初步筛选培育VP7-U胡萝卜阳性植株。

1.2.2 PCR引物扩增 VP7-U正向引物：AGGATCTATGGACACTG，反 向 引 物：ATTAGATCCACCAACTTG；在25μL体系中，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L-1）1.0μL，引 物 （0.01 mmol·L-1）各0.5μL，模板 DNA 1μg，Tag酶（2.5 U）0.8μL，补双蒸水至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性50s、50℃退火60s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

1.2.3 转VP7-U基因胡萝卜的Western Blot

转基因胡萝卜蛋白的提取：取新鲜的转基因胡萝卜根0.4g，用液氮冷冻研磨成粉末，加入200μL蛋白提取缓冲液，2～3h样品充分溶解后，4℃，12 000r·min-1，离心20min。取上清液备用。

SDS-PAGE和蛋白质的电转印：用8%的SDS-聚丙烯酰胺分离胶和5%的浓缩胶，20mA，2h。待蛋白Maker完全分离后进行电转印。醋酸纤维素膜，伯乐电转仪60V，3h转膜，转膜后用3%BSA封闭，4℃过夜，PBST洗涤3次后加入一抗室温孵育2h，再次洗涤3次后加入辣根过氧化物标记的二抗孵育2h，洗涤后用DAB显色液染色。

1.2.4 转基因胡萝卜中VP7-U蛋白免疫原性及浓度的检测 以轮状病毒VP7基因蛋白为阳性并按一定配比稀释，以黑田五寸为阴性对照，样品胡萝卜蛋白以1／50倍比稀释，每个浓度做3次平行，3%BSA封闭，一抗用兔抗VP7血清，二抗用辣根过氧化酶标记的山羊抗兔血清，酶联反应后洗涤，DAB显色后加入1mol·L-1的盐酸终止反应。于酶标仪在A450nm，A655nm读取数值。根据VP7阳性蛋白稀释比做标准曲线，根据标准曲线测定胡萝卜蛋白中目的蛋白的含量，并计算出所占胡萝卜总蛋白的比例。

1.2.5 转基因胡萝卜目的蛋白抗原性的检测

免疫小鼠：利用提取的胡萝卜蛋白灌服4周龄的小鼠，4只为一组。目的蛋白量20～30mg，同时保证阴性蛋白和阳性蛋白的总蛋白量相同，免疫周期为1周。免疫4次后7d采血，3 000r·min-1，10min，4℃离心，取血清，ELISA方法检测不同小鼠体内的IgG含量，并计算出每组小鼠的OD值平均值。

2 结果分析

2.1 pBI121S.P.VP7-U构建图 其启动子为35S启动子，VP7基因前有一段烟草S.P（图1）。

图1 pBI121S.P.VP7 -U 构建图Fig.1 Construction for pBI121S.P.VP7-U

2.2 PCR 利用特异性引物对目的基因进行扩增，结果可以扩增出621bp的目的片段（图2）。

2.3 Western Blot 由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可以明显地看出37KD处的目的蛋白条带，说明目的基因在蛋白水平上有表达（图3）。转膜后利用兔抗VP7为一抗（中国科学院微生物研究所赠），山羊抗兔-HRP为二抗孵育，DAB染色后可明显看到37KD处的目的蛋白印记，进一步说明优化后的VP7基因在蛋白水平上得到表达（图4）。

图2 部分转VP7 -U 基因胡萝卜株PCR结果Fig.2 PCR detection of carrots transformed VP7 -U gene

图3 8%SDS-PAGE分离胡萝卜根部蛋白结果Fig.3 Detection of carrot root protein with 8%SDS-PAGE

图4 胡萝卜根部蛋白的转膜结果Fig.4 Analysis of protein in carrot root with Western Blot

2.4 目的基因在转基因胡萝卜中的表达量比较转基因与非转基因胡萝卜的测定结果，转基因胡萝卜的OD值明显高于阴性对照，说明转基因胡萝卜蛋白中含有免疫活性的抗原蛋白（图5）。以细菌阳性蛋白做标准曲线，根据标准曲线得出各个转基因胡萝卜中的抗原含量，选取最高OD值的植株为灌服材料，并根据BCA试剂盒得出该植株可溶性总蛋白的含量，确定小鼠的灌服量，同时计算出该植株所含目的抗原在其可溶性总蛋白中的比例（表1）。随机选取转VP7-U基因胡萝卜与转VP7基因胡萝卜6株，通过ELISA检测后分别得出OD值平均值，并与阴性对照比较，结果表明，转VP7-U基因胡萝卜的活性抗原蛋白含量要高于转VP7基因的胡萝卜（图6）。

图5 ELISA检测活性目的抗原结果Fig.5 Detection of active antigen with ELISA

表1 喂服小鼠的抗原量及胡萝卜蛋白总量Table 1 Amount of antigen and carrot total protein given to mice

2.5 灌服不同蛋白的小鼠体内的IgG比较结果表明，灌服阳性胡萝卜蛋白的IgG高于未灌服和灌服阴性胡萝卜蛋白的两组（图7）。

3 讨论

轮状病毒导致婴幼儿腹泻，目前还没有可有效治疗的药物。疫苗预防接种是遏制轮状病毒腹泻唯一的有效手段，而转基因植物口服疫苗是一种非常有前景的新型疫苗。口服疫苗到达肠内粘膜诱导部位之前要经过胃肠内的不利环境，所以必须要受到保护，否则会失去免疫性［8］。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可使细胞中的疫苗抗原通过胃内的不利环境时受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，诱导黏膜和全身免疫反应。不仅如此，转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织（GALT）产生分泌性的IgA（sIgA），在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应，从而大大提高其免疫有效性［9］。利用转基因植物生产出来的口服疫苗要经过动物和人体试验，以验证其能否引起机体产生免疫反应，一般先要经过小鼠试验。实验中将转基因植物提取液对小鼠进行灌胃或提取转基因植物中表达的抗原注射小鼠［10-12］，检验小鼠血清中是否存在抗体。

图6 转VP7 基因和VP7 -U 基因胡萝卜的ELISA结果Fig.6 ELISA detection to carrots transformed VP7 gene and VP7 -U gene

图7 灌服不同蛋白的小鼠体内的IgG平均含量比较Fig.7 Comparison of IgG in different mice gave different proteins

本研究以胡萝卜为植物受体，整合优化的人源轮状病毒VP7基因，经过PCR初步检测，Western blot和ELISA蛋白水平上的检测后［13］，将有蛋白表达的转基因胡萝卜提取液灌服4周龄小鼠，结果表明，灌服VP7阳性细菌蛋白的4只小鼠中有3只的IgG明显高于灌服阴性胡萝卜蛋白的小鼠；灌服阳性胡萝卜蛋白的3只小鼠中，两只小鼠的IgG明显高于灌服阴性胡萝卜的小鼠，比灌服阳性细菌蛋白的小鼠的IgG含量低，但阳性小鼠同阴性小鼠体内的IgG含量差异不显著。其原因除了小鼠个体差异，还可能是因为阳性细菌蛋白的纯度较高，而所用的灌服蛋白是提取的胡萝卜粗蛋白，存在一定量的杂蛋白，同时胡萝卜蛋白中部分杂蛋白的分子量和蛋白结构可能与抗原蛋白相近，减少了抗原蛋白在胡萝卜可溶性蛋白中的相对含量。由于细菌蛋白制备成口服疫苗还需要复杂的后加工过程，并且不能在室温下保存，运输利用也需要一定的条件；而转基因胡萝卜中的抗原由于胡萝卜生物系统的保护，相较于细菌来说可长期具有生物活性，并且耐储存、易运输等特点凸显了转基因胡萝卜的优势。本研究用ELISA法检测插入胡萝卜中优化的VP7蛋白同时得出其浓度，结果表明，优化后的VP7蛋白在可溶性蛋白中的比例要高于正常的VP7蛋白所占的比例，在一定程度上提高了抗原量。虽然转基因胡萝卜口服疫苗制作还有很多问题和困难，但随着研究的不断深入，通过生食一根胡萝卜而预防轮状病毒的构想在不久的将来终会实现。

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