李 琨，安 莹 综述;陈发明，金 岩 审校

(第四军医大学口腔医学院，陕西西安710032)

随着近代细胞生物学和分子生物学的发展和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)的发现，为多种组织缺损修复再生治疗策略提供了机遇。组织再生依赖于缺损区域细胞、生物材料和信号分子的共同作用，其中足够的可供新组织形成或再生的干细胞、与缺损组织性能和成分相似的支架材料，以及促进细胞增殖、分化和归巢的诱导因子等都至关重要［1］。近几年，医学领域已经开始探索利用合适的干细胞去实现人体组织和器官的修复和重建，并逐渐聚焦于解决临床问题［2］。再生医学已经成为医学研究的一个重要分支，在将来的临床治疗中必将发挥越来越重要的作用，而干细胞具有自我更新的能力和多向分化的潜能［3］，是再生医学研究的重点和核心［4］。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是多能干细胞，可以分化为多种成体细胞［5］，但因受伦理和法律的限制而在其研究和应用中存在争议［6］。MSCs是一种多能成体干细胞，最初从人的骨髓中分离得来，随后又在成人和胎儿的其他组织中发现［7］。成体干细胞(adult stem cells)通常依据其所处部位不同而命名为不同种类的干细胞，例如骨髓干细胞、神经干细胞、牙源性干细胞等。近年来研究表明:来自同一种组织的干细胞也可以产生完全不同的其他组织细胞［3］。成体干细胞与ESCs不同可以用于临床疾病的治疗，如心肌缺血、组织缺损修复、糖尿病和帕金森病等［7］。目前研究表明，在脑、脊髓、外周血、血管、骨骼肌、上皮、视网膜、肝脏、胰腺等3个胚层来源的组织中都发现了成体干细胞，包括牙齿组织。近年来，牙源性干细胞作为组织工程学的候选细胞，越来越引起广泛的重视和关注［8］，其不仅可用于口腔组织的再生，也适用于非口腔组织如骨和神经等组织的再生［8-9］。本文就常见的牙源性干细胞的研究进展及其在组织工程学中的应用等作一综述。

目前研究发现在口腔的不同组织中均分离出干细胞［10］。Gronthos等［11］(2000)报道了从人的牙髓组织中分离并培养干细胞的方法，这些干细胞可集落状生长、体外可诱导分化为成牙本质样细胞并形成具有牙本质样结构的组织，从而首次提出了牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的概念。随后，其他组织的牙源性干细胞也陆续被成功分离，包括牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、根尖乳头干细胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)和牙囊干细胞(dental follicle stem cells，DFSCs)等。目前认为:牙源性干细胞均为存在于口腔组织中的未分化间充质干细胞，具有自我增殖和多向分化的能力，与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs)相比，具有更强的多向分化潜能和更强的诱导成脂、成骨、成神经组织等能力［7］。以下就牙源性干细胞的生物学特性、细胞表型、分化能力、临床转化等方面的研究概况进行分述。

1 牙髓干细胞(DPSCs)

Gronthos［10］等(2000)利用酶消化法，将人健康的第三磨牙牙髓制成单细胞悬液进行培养，发现牙髓细胞在体外培养时可自我更新并高度增殖和多向分化;将其移植到免疫缺陷的小鼠体内能产生牙本质-牙髓复合体，而且在一定因素诱导条件下，还能分化为多种细胞，与干细胞的定义相符。于是作者推测，牙髓中可能含有干细胞，并首次提出了牙髓干细胞(DPSCs)的概念［11］。

1.1 DPSCs的来源和细胞表型

Gronthos等［11］(2000)最初推测DPSCs可能来源于血管周围的微环境;此后shi等［12］(2001)也发现DPSCs表达STRO-1和CD146两种早期间充质干细胞的表面标志，认为DPSCs与血管组织密切相关。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现:DPSCs存在于全部牙髓之中，在根髓中的密度更高［13］。但关于DPSCs的确切来源目前还不甚清楚，因而对其进行确切定位、分离鉴定的研究仍在进行。

关于DPSCs的细胞表型，组织化学染色显示DPSCs除表达波形丝蛋白、成纤维细胞生长因子等成纤维细胞的标志外，还表达内皮细胞的相关标志如内皮细胞粘附因子VCAM-1、第Ⅷ因子以及平滑肌的标志如平滑肌肌动蛋白和骨标志如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥素等;不表达软骨标志Ⅱ型胶原和上皮细胞的标志EMA［14］。DPSCs细胞表型的多样性和表达强弱的差异表明:DPSCs克隆株的不均一性，可能是由处于分化和发育不同阶段的细胞组成。DPSCs表达平滑肌和内皮细胞的标志，提示其有可能来源于发育的血管［15］。而DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DPSCs尚处于未分化状态［10］。

1.2 DPSCs的生物学特性

1.2.1 DPSCs有高度增殖和自我更新能力

Gronthos等［11］(2000)在体外培养的的第一代DPSCs和BMSSCs中加入Brdu后检测细胞的增生率发现:DPSCs的增生率高于BMSSCs，DPSCs约有72%阳性细胞，而BMSSCs约有46%阳性细胞;同时还发现DPSCs的克隆形成率为0.22%～0.70%，远高于BMSSCs的0.024%～0.031%。

1.2.2 DPSCs的多向分化能力

DPSCs具有成体干细胞的可塑性(plasticity)，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种不同细胞［16］。成骨诱导分化实验显示:体外矿化诱导DPSCs 40 d后，骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)免疫荧光染色阳性，可见骨小梁结构;随后将此骨样组织回植入免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后形成发育良好的板状骨，表明DPSCs在特定矿化条件下有成骨能力［17］。成脂诱导分化实验显示:用含0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、0.5(nlU)mmol/L氢化可的松、60(nlU)mmol/L消炎痛的成骨成脂诱导液对DPSCs进行成脂诱导5周后，可见油红O染色阳性的脂滴;进一步RT-PCR检测发现，脂肪细胞所具有的两种特异性转录因子表达上调，表明体外培养的DPSCs具有向脂肪细胞分化的潜能［18］。成神经诱导分化实验显示:DPSCs在mRNA和蛋白质水平分别表达神经巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)［18］;DPSCs能为多巴胺能的神经元提供营养支持，而且在体外可分化为神经元，表明DPSCs具有向神经细胞分化的潜能［19］。此外，有研究证实:DPSCs经条件培养基的诱导还可分化为肌细胞、软骨细胞等，进一步丰富了DPSCs可分化的细胞谱系［20］。

生长因子具有促进或抑制细胞分裂增殖、迁移和基因表达的作用。在成年牙髓组织再生、损伤修复过程中，存在于髓周牙本质中的生长因子、特殊的牙髓胞外基质分子以及由修复中的牙髓细胞合成的生长因子和胞外基质分子等细胞因子都对DPSCs的增殖分化起着重要作用，共同形成DPSCs生存、增殖和分化的微环境。如:转移生长因子家族(TGF-β superfamily)的主要成员TGF-β1可以促进DPSCs碱性磷酸酶的表达，参与修复性牙本质的形成;骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein 2，BMP 2)能够刺激DPSCs分化表达DSPP的成牙本质细胞［21］。牙本质基质蛋白-1(dentin matrixprotein 1，DMP-1)也可促进DPSCs的增殖，对DPSCs碱性磷酸酶活性的促进作用呈浓度依赖性。另有许多研究结果表明:胰岛素样生长因子Ⅰ、肿瘤坏死因子α、表皮生长因子(EGF)等细胞生长因子亦参与DPSCs向成牙本质细胞分化过程的调节［22］。

1.3 DPSCs的应用展望

随着DPSCs研究的进一步深入和组织工程学的进一步发展，DPSCs为促进牙髓组织再生、牙体修复、自体牙的再造、甚至骨组织的修复重建等开辟广阔的前景。但牙髓干细胞的研究目前仍面临很多问题，如DPSCs特异性标志尚不明确，在牙髓组织中的确切定位还不明了，要实现精确的定位分离纯化还有一定困难;以及DPSCs数量少、易老化、体外培养扩增难度大、周期长;而且对于干细胞的分裂、分化的具体调节机制尚不清楚，相关的信号分子的作用也还需进一步研究探索等。这些问题均说明:DPSCs还有很大的研究空间，要把DPSCs应用于临床还需要细胞研究的进一步完善以及组织工程学技术的进一步发展。

2 牙周膜干细胞(PDLSCs)

PDLSCs是近来发现的来源于牙周韧带组织的成体干细胞。Byoung-Moo等［23］(2004)用酶消化法将健康成年人的牙周膜组织制成单细胞悬液进行体外培养，通过克隆筛选和磁珠分离得到了具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞，从而提出了牙周膜干细胞(PDLSCs)的概念。正常情况下，牙周膜细胞可通过增殖和分化使其本身以及与之相连的牙骨质和牙槽骨处于不断更新和改建的状态。而当受到疾病或外界刺激时，则可通过牙周膜中干细胞的不断增殖和分化使组织再生［24］。

2.1 PDLSCs的来源和细胞表型

研究发现:牙周组织发育完成后存在于牙周膜中的未分化的间充质细胞具有自我更新和多向分化等特点，不少学者认为牙周膜是一个能自我更新的系统，存在原始的能产生不同表型的干细胞或称为牙周膜前体细胞，这些能导致牙周组织再生的前体细胞主要来源于牙周膜和牙槽骨［25］。

关于PDLSCs的细胞表型，免疫组化结果显示PDLSC表达间充质干细胞的标志物，而这些标记物是鉴定PDLSC的基础［26］。包括:间充质干细胞标志物:SRTO-1、CD146/MUC18;腱细胞标志物:碱性螺旋-环-螺旋转录因子(Scleraxis);骨髓间充质干细胞表面标志物:CD90、CD29、CD44、CD166、CD105、CD13等［27］。

2.2 PDLSCs的功能研究

PDLSCs具有成体干细胞的基本特性，即具有自我更新和多向分化的潜能，可产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，以维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用。具有自我更新能力，可以通过分裂维持自身群体的稳定，并能在体外克隆性生长［28］;具有不定向分化潜能，在不同的生长因子微环境条件下，可以诱导向脂肪细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、软骨细胞和神经元样细胞分化，还可形成牙骨质、牙周膜和牙槽骨等，是牙周组织再生最直接、最可靠的种子细胞，也是牙周缺损细胞治疗和基因治疗重要的细胞学基础［29］。

2.3 PDLSCs的展望

利用干细胞使病变破坏的牙周组织再生已研究多年［30］，PDLSC在体内能使破坏的牙周组织形成新的附着，是牙周组织工程学和牙周组织再生术的重大进步，为以干细胞为基础的组织工程提供了基础，在牙周生理功能维持、病理损伤修复中的重要作用和牙周再生方面存在的巨大潜能，必将为口腔基础和临床研究打开新的突破口，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。但因其存在来源有限，培养分离纯化扩增过程复杂、周期较长等实际问题，要应用于临床治疗中仍需进一步研究。

3 乳牙牙髓干细胞(SHED)

Miura等［31］(2003)研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。这种细胞在一定的体外诱导条件下具有成骨、成牙本质，以及分化为其他非牙源性间质细胞的能力。

3.1 SHED的来源和细胞表型

对SHED进行表型研究和蛋白组学分析发现，其可表达多种间充质干细胞的特异性分子标志，包括CD73、CD90、CD105、CD146、STRO-1，但是不表达造血干细胞的标志，如CD14、CD34、CD45等，提示SHED很可能来源于间充质［31-32］。Miura等［31］将体外扩增的SHED移植到免疫缺陷小鼠体内，观察到类牙本质样结构形成，进一步免疫组化检测显示其牙本质特异性蛋白—牙本质涎磷蛋白(DSPP)阳性，表明其可以分化为成牙本质细胞。尽管Miura等证明SHED在体内无法向成骨细胞分化，但Shen YY等［33］(2010)发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;同时Miura等［31］还发现SHED经神经诱导培养后表达多种神经细胞的标志，如巢蛋白、GAD、βⅢ-tubulin、NeuN、GFAP、NFM、CNPase等;经成脂诱导培养，SHED呈现出油红-O染色阳性的特征，并且半定量RT-PCR检测显示过氧化物酶体增殖子活化受体-γ2和脂蛋白脂酶这两种脂肪细胞特异性的转录因子表达上调，提示SHED可以分化为脂肪细胞［33］。

3.2 SHED的功能研究

相关研究表明，SHED具有多向分化功能，Miura等［31］通过将体外扩增的SHED移植到免疫缺陷的动物体内，可观察到类牙本质样结构;将SHED接种于支架材料并植入免疫缺陷小鼠皮下，可观察到牙髓样结构形成［34］;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志(DSPP，DMP-1，MEPE)［35］。

有研究发现:SHED移植到裸鼠体内后，虽不能直接分化形成成骨细胞，但可以诱导宿主细胞分化为成骨细胞，提示SHED具有骨诱导功能，而这种功能是DPSCs(甚至其他牙源性干细胞)所不具备的［34］。虽然一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞［36］，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞，究竟是何种原因导致的这一有趣现象，至今尚未得到解答。此外，在一定的诱导条件下SHED还可以分化为多巴胺能神经元样细胞;可以向血管内皮细胞分化，同时形成可与宿主脉管系统相吻合的微血管;可以在一定条件下被诱导转化为人工诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)［7］;SHED可能还具有参与机体的免疫调节等功能［37］。

3.3 SHED展望

SHED自被成功分离以来已被证实具有较强的增殖能力和多向分化的潜能，尤其具有显著的诱导成骨能力，并且可能参与机体的免疫调节过程，具有广阔的研究空间。但还有许多具体分子作用机制仍不明确，尚需大量试验研究去探索。

4 根尖乳头干细胞(SCAP)

SCAP存在于未完全发育成形的恒牙根尖周组织中，是一种具有高度增生、自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。Sonoyama等［38］(2006)研究发现:虽然根尖周牙乳头组织中的血管和细胞成分均较牙髓组织少，但在根髓组织与根尖周牙乳头组织交界处有一个非常明显的细胞富集区，而且根尖周乳头状组织阳性表达间充质干细胞表面分子STRO-1，从而推测该区域可能存在干细胞或前体细胞。为了证实这种假定的细胞，Abe等［39］(2007)从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，能够像其他间充质干细胞一样形成贴壁生长的克隆原细胞聚集，并具有成骨、成牙本质和成脂等多向分化潜能，因而作者将这种细胞命名为SCAP。SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的重要来源，在牙根的形成和发育中起着重要的作用，具有强于DPSCs的群体倍增能力以及增殖率、端粒酶活性和细胞迁移率，是一种极具潜力的成体干细胞［40］。SCAP独特的功能和特点决定了其不仅仅是一种研究牙根发育时成牙本质细胞分化机制的体外细胞，而且是一种很好的牙组织工程种子细胞，可用于牙髓、牙本质的再生和生物学牙根的再生，具有极其良好且广阔的临床应用前景。

5 牙囊干细胞(DFPC)

牙囊(dental follicle，DF)是包绕发育牙齿的疏松结缔组织［41］，其组织来源于外胚间充质，是牙骨质、牙槽骨和牙周膜的起源组织，含有干细胞和形成牙周组织的前体细胞亚群，在一定诱导条件下进行体外培养时可分化为成骨样或成牙骨质样细胞［42］。DFPC可从特定的组织中分离、培养得到，这类干细胞的特点使其在组织工程学研究中具有很大的潜能，可应用于牙周和骨的再生研究。Honda等［41］(2010)从小牛牙根形成阶段的恒切牙牙胚中分离出牛DF细胞，进行了一系列试验，证明DF细胞中含有牙周膜细胞及牙骨质细胞的前体细胞;Luan等［43］(2006)在形态、增殖能力、矿化特征等方面进行了试验，证实DF前体细胞具有异质性。上述研究结果表明:牙囊中存在具有多向分化潜能的干细胞，在一定诱导条件下可诱导分化为成牙骨质细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。因此，在牙周组织再生的研究中，DF细胞被视为可能的种子细胞，研究前景值得关注。

6 小结

尽管牙源性干细胞的研究和临床应用虽已取得了许多突破，但其仍处于起步阶段，若要成功应用于临床，实现真正意义上的组织再生，仍有许多理论机制尚待研究，许多技术操作问题尚待克服。然而，因牙源性干细胞本身具备其他组织工程种子细胞所无法比拟的优点，如:自我更新能力强，多向分化潜能大，易于获得，自体移植免疫排异反应小，不存在伦理上的争议等，使其在牙齿组织工程学的应用上具有广阔的前景。有理由相信，随着牙源性干细胞研究的不断深入和组织工程技术的不断发展，将给医学的理论研究和临床应用带来革命性的进展。

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