刘 涛，赵 令，张彦东，王 凯，马 宁，姜振宇

（吉林大学第一医院风湿免疫科，吉林 长春130021）

环磷酰胺对儿童系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞亚群变化的影响

刘 涛，赵 令，张彦东，王 凯，马 宁，姜振宇

（吉林大学第一医院风湿免疫科，吉林 长春130021）

目的：探讨环磷酰胺对儿童系统性红斑狼疮 （SLE）患者外周血淋巴细胞亚群变化的影响，为治疗儿童SLE提供依据。方法：选取30例儿童SLE患者和30例健康儿童，检测其外周血T细胞、B细胞、自然杀伤 （NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞水平。将SLE患者分为单纯激素治疗组和环磷酰胺联合激素治疗组，每组各15例，采用流式细胞术检测2组治疗前后儿童外周血淋巴细胞亚群比率的变化。结果：与健康对照组比较，SLE患儿组CD3＋CD4＋Th细胞比率明显降低 （P＜0.05）；CD3＋CD8＋Tc细胞比率明显升高 （P＜0.05）；CD3－（CD16CD56）＋NK和CD3＋（CD16CD56）＋NKT细胞比率明显降低 （P＜0.05），而CD3－CD19＋B细胞比率明显增高 （P＜0.01）。儿童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc细胞比率与SLE活动指数 （SLE DAI）呈正相关关系 （r＝0.754 7，P＜0.01）；CD3－CD19＋B细胞比率与SLEDAI亦呈明显的正相关关系 （r＝0.158 6，P＝0.029 3）；Th、NK和NKT细胞比率与SLE DAI无明显相关性 （P＞0.05）。与治疗前比较，单用激素治疗组患者治疗后B细胞比率明显降低 （P＜0.05）；NK、NKT和Th细胞比率均有所升高，Tc细胞比率降低但差异无统计学意义 （P＞0.05）。环磷酰胺联合激素组治疗后患者B细胞比率较治疗前明显降低 （P＜0.01），NK细胞、Th细胞比率较治疗前明显升高 （均P＜0.01）。结论：儿童SLE患者淋巴细胞亚群比例的失调与SLE的发病有关，环磷酰胺联合激素治疗儿童SLE效果较好。

系统性红斑狼疮；环磷酰胺；淋巴细胞亚群；儿童

与成人比较，儿童系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus，SLE）临床表现更加复杂多样，症状较重，治疗存在难度，病因和发病机制尚不清楚。普遍认为：T、B细胞在SLE的发生发展中起关键作用，且自然杀伤 （natural killer，NK）细胞和自然杀伤T （natural killer T，NKT）细胞亦与SLE发病密切相关。环磷酰胺是临床常用的免疫抑制剂，可以抑制体液和细胞免疫而起到治疗SLE的作用。研究［1］证实：环磷酰胺可影响不同的T细胞亚群，导致CD4＋／CD8＋比值变化，并可抑制B细胞的产生，从而减少自身抗体的数量。但目前关于环磷酰胺对儿童SLE患者淋巴细胞亚群的影响研究较少。本研究旨在探讨环磷酰胺对儿童SLE患者外周血淋巴细胞亚群的影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月—2012年1月本院儿童SLE患者 （≤16岁）30例，男性2例，女性28例，平均年龄 （10.0±4.2）岁；SLE活动指数 （SLE DAI）为3～35，平均为13；抗－双链DNA阳性率为80%，补体C3为0.48（0.30～0.91），补体C4为0.10（0.03～0.19）。30例患者随机分为单纯激素治疗组和环磷酰胺联合激素治疗组，每组15例。单纯激素治疗组患者给予泼尼松龙1mg·kg－1·d－1静点，环磷酰胺联合激素治疗组患者给予环磷酰胺每周0.4g、联合1.0mg·kg－1·d－1泼尼松龙，治疗4周。所有患者诊断均符合1997年美国风湿学会 （ACR）修订的SLE分类诊断标准［2］。疾病活动指数参照SLE DAI评分，分数≥6为疾病活动期。所有患者均为初发SLE，排除系统性硬化、肌炎或其他自身免疫疾病，或过去的6个月已经给予免疫抑制剂或糖皮质激素治疗的SLE患者。在门诊选取30例健康儿童作为健康对照组，男性2例，女性28例，平均年龄 （11±3）岁，各组儿童年龄、性别差异无统计学意义 （P＞0.05）。

1.2 流式细胞术检测各组儿童外周血淋巴细胞亚群比例 每个儿童采集150μL血液，平均分配至3个采样管中。第1个采样管中加入异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）耦联CD4单克隆抗体、多甲藻黄素－叶绿素－蛋白质复合物（peridinin－chlorophyll－protein complex，PerCP）耦联CD3单克隆抗体和聚乙烯 （polyethylene，PE）耦联CD8单克隆抗体各5μL；第2个采样管中加入FITC耦联CD3单克隆抗体和PE耦联CD19抗体各5μL；第3个采样管中加入FITC耦联CD3单克隆抗体和PE耦联CD16CD56单克隆抗体各5μL。样本在室温下放置0.5h后，加入FACS红细胞裂解液 （美国BD公司产品），静置6min。用PBS缓冲液洗2次，应用流式细胞仪的数据分析软件 （v5.7.2）分析各组儿童淋巴细胞亚群比率。

1.3 统计学分析 采用SPSS 14.0统计软件分析数据。各组儿童外周血各淋巴细胞亚群比率以±s表示，组间比较采用χ2检验。淋巴细胞亚群比率与SLE DAI的相关性分析采用等级相关分析。

2 结 果

2.1 各组儿童外周血各淋巴细胞亚群的变化 儿童SLE患者CD3＋CD4＋Th细胞比率 （26.930%±1.682%）明 显 低 于 健 康 对 照 组 （38.420% ±1.301%） （P＜0.01）；而患儿CD3＋CD8＋Tc细胞比率 （32.590%±2.096%）较健康对照组患儿（19.570%±1.155%）明显升高 （P＜0.01）；儿童SLE患者CD4＋／CD8＋比值显著下降；儿童SLE患 者 CD3－（CD16CD56）＋NK 细 胞 比 率（5.606%±0.348%）、CD3＋（CD16CD56）＋NKT细胞比率 （0.973%±0.091%）较健康对照组［（14.550%±0.482%）、（4.433%±0.284%）］明显降低 （P＜0.01）；而患儿CD3－CD19＋B细胞比率 （15.300%±1.644%）较健康对照组儿童（7.406%±0.457%）明显增高 （P＜0.01）。见图1。

图1 SLE组与健康对照组儿童各淋巴细胞亚群比率Fig.1 The ratios of lymphocyte subsets of children in SLE and health control groupsA：Th cells；B：Ts cells；C：NK cells；D：NKT cells；E：B cells.

2.2 儿童SLE外周血淋巴细胞亚群比率与SLE DAI的相关性分析 儿童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc细胞比率与SLE DAI呈正相关关系 （r＝0.754 7，P＜0.01）。CD3－CD19＋B细胞比率与SLE DAI亦呈明显的正相关关系 （r＝0.159，P＝0.029，）。Th （r＝0.256，P＝0.625）、NK （r＝0.458，P＝0.089）、NKT （r＝0.574，P＝0.376，）细胞比率与SLEDAI有明显相关性。

2.3 各组患者外周血淋巴细胞亚群比率 单用激素治疗组治疗后患者B细胞比率 （10.180%±1.360%）较治疗前 （16.400%±2.171%）明显降低 （P＜0.05）；NK细胞比率 （8.741%±0.462%）、NKT细胞比率 （1.375%±0.028%）和Th细胞比率 （30.250%±0.987%）均较治疗前 （5.587%±0.198%）、 （0.987%±0.123%）和 （23.540±1.225%）升高，Tc细胞比率治疗后 （30.120%±1.547%）较治疗前 （33.710%±2.581%）降低，但治疗前后差异无统计学意义 （P＞0.05）。环磷酰胺联合激素组患者治疗后CD3＋CD4＋Th细胞比率 （40.620%±1.118%）、CD3－（CD16CD56）＋NK细胞比率 （14.380%±0.665%）较治疗前（26.460%±2.886%）、（5.807%±0.501%）明显升高 （P＜0.01）。CD3－CD19＋B 细 胞 比 率（6.934% ±0.651%） 较 治 疗 前 （14.200% ±2.514%）明显降低 （P＜0.01）。见图2。

图2 治疗4周后单用激素组与环磷酰胺联合激素组SLE患儿B、Th和NK细胞比率Fig.2 The ratios of B，Th and NK cells of SLE patients in hormone therapy group and cyclophosphamide combined with hormone therapy group 4weeks after treatmentA：Hormone therapy group；B－D：Cyclophosphamide combined with hormone therapy group；A，B：B cells；C：Tc cells；D：NK cells.

3 讨 论

儿童SLE是儿童常见的、严重的自身免疫性疾病，T细胞亚群的紊乱可能在疾病的发生、发展中发挥着重要的作用，而CD4＋T细胞与CD8＋T细胞的相互制约与平衡对机体免疫应答具有重要的调节作用。本研究结果显示：儿童SLE患者中CD8＋T细胞较健康组明显升高，CD4＋T细胞明显降低，CD4＋／CD8＋比值显著下降。而既往研究［3－4］显示：SLE患者中CD4＋T细胞增多或CD8＋T细胞减少、CD4＋／CD8＋比例异常，因此认为SLE的发病是由于CD8＋T细胞亚群的减少、功能缺陷所致的B细胞多克隆抗体激活和体液免疫异常所致。但也有研究［5］显示：大部分SLE患者外周血中CD8＋T细胞数量未见降低，尤以具有反抑制活性的CD8＋T细胞高表达最为明显，因此不能发挥CD8＋T细胞对于CD4＋T细胞的抑制作用，同时由于CD4＋T细胞的减少，尤其是具有抑制诱导作用的T细胞的减少，不能诱导CD8＋T对B细胞产生抑制作用［6－7］，因此SLE患者虽有CD4＋T减少，CD8＋T正常或稍高，但仍表现为体液免疫亢进，B细胞增殖并产生大量自身抗体。B细胞的功能异常在SLE的发病机制中发挥着重要的作用。本研究结果显示：儿童SLE患者中B细胞比率较健康对照组明显升高。传统观点认为：B细胞在SLE的发病过程中是抗体依赖性的，但新近有研究［8］显示：B细胞的抗原提呈、激活T细胞并促进其分化、调节树突细胞等功能异常，可能在SLE的发病过程中起更为重要的作用。

NK细胞作为天然免疫系统的一部分，不仅具有自然杀伤功能，对肿瘤细胞和病毒感染细胞有较强杀伤作用，而且对体内多种细胞，尤其是T、B细胞具有免疫调节作用。本研究结果显示：SLE患者NK细胞数量明显降低，与此前的研究［9－10］结果相似，治疗后NK细胞较治疗前升高，提示NK细胞的变化可以直接地反映机体的免疫失衡状态。有研究［11－12］显示：体内较高水平的循环免疫复合物可能是导致NK细胞数量减少和细胞毒作用低下的重要原因。NKT细胞是一种特殊类型的T细胞，同时表达NK细胞和T细胞标记，是获得性免疫和天然免疫连接的桥梁。近年来，有文献［13－14］报道：NKT细胞数量的减少和功能缺陷与SLE的发病有关，但具体作用仍需进一步研究。本研究结果显示：SLE患者NKT细胞比率明显降低，与文献［13－14］报道结果一致。本研究结果显示：淋巴细胞各亚群比率与SLE DAI有相关关系，T细胞亚群、B细胞和NK细胞的改变在SLE的发病中起重要作用，故检测SLE患者外周血淋巴细胞亚群可了解机体的免疫状态，对正确判断病情和指导临床治疗有重要意义。

由于大多数的SLE患儿均累及内脏，而且病情变化较快，所以大部分患儿需以激素作为首选治疗药物。糖皮质激素对免疫细胞的许多功能以及免疫反应的各个环节均有明显的抑制作用，尤其对细胞免疫的作用突出；大剂量应用激素时还可明显抑制体液免疫反应，减少抗体产生；超大剂量应用激素则有直接的淋巴细胞溶解作用。本研究结果显示：单用激素4周后，B细胞比率明显降低，NK、NKT和Th细胞比率均较治疗前升高，Tc细胞比率较治疗前降低，但两组间差异均无统计学意义，可能是因为样本量不足和时间有限所致。环磷酰胺可以影响T细胞亚群，造成CD4＋／CD8＋比值改变，同时还可以抑制B细胞的生成和抗体数量减少，是治疗重症SLE的有效药物，特别是针对狼疮性肾炎患者。本研究结果显示：环磷酰胺联合激素治疗4周后，Th细胞比率较治疗前明显升高，超过基线水平，十分接近健康对照组水平，B细胞比率较治疗前明显降低；另外治疗后NK细胞比率较治疗前也有所升高，治疗前后细胞比率的变化均有统计学意义。而单用激素组治疗患者，与治疗前比较，仅B细胞比率的降低差异具有统计学意义，其他细胞并未发生具有统计学意义的变化。本研究结果表明：激素和环磷酰胺均可以引起T细胞亚群的变化，环磷酰胺联合激素治疗SLE的效果明显优于单用激素。

［1］Kapitsinou PP， Boletis JN， Skopouli FN， et al.Moutsopoulos HM lupus nephritis：treatment with mycophenolate mofetil［J］.Rheumatology（Oxford），2004，43 （3）：377－380.

［2］Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，1997，40 （9）：1725.

［3］游 弋，郝 飞，邓永健.免疫磁珠法检测系统性红斑狼疮患者外周血T细胞亚群及其意义 ［J］.第三军医大学学报，2005，27 （7）：649－651.

［4］赵高阳.儿童系统性红斑狼疮外周血淋巴细胞亚群变化的临床意义 ［J］.中国中西医结合儿科学，2011，3 （2）：179－180.

［5］张冬青，王树军，马安伦，等.SLE中的反抑制细胞与γδ TCR阳性T细胞 ［J］.风湿病学杂志，1997，2 （4）：1－4

［6］周 同，江永梯，姚 建，等.SLE患者CD45RA＋和CD45RO＋T细胞亚群的变化 ［J］.中国免疫学杂志，1995，11 （6）：374－376.

［7］姚艳华，陈志伟，顾国浩.外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞与系统性红斑狼疮活动性的关系 ［J］.苏州大学学报：医学版，2006，26 （2）：268－270.

［8］何德宁，董光富.B细胞在系统性红斑狼疮中发病机制的研究进展 ［J］.中华风湿病学杂志，2011，15 （2）：133－136.

［9］Erkeller－Yuksel FM，Lydyard PM，Isenberg DA.Lack of NK cells in lupus patients with renal involvement ［J］.Lupus，1997，6 （9）：708－712.

［10］Stoh W，Elliott JE，Hamilton AS，et al.Impaired recovery and cytolitic function of CD56＋T and non－T cells in systemic lupus erythmatosus following in vitro polyclonal T cell stimulation：studies in unselected patients and monozygotic disense－discordant twins ［J］. Arthritis Rheum，1996，39 （11）：1840－1851.

［11］Jimenez S，Cervera R，Font J，et al.The epidemiology of systemic lupus erythematosus ［J］.Clin Allergy Immunol，2003，25 （1）：3－12.

［12］石永兵，沈华英，施晓松.系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群及NK细胞变化及其临床意义 ［J］.苏州大学学报：医学版，2005，25 （6）：1033－1034.

［13］Takahashi T，Strober S.Natural killer T cells and innate immune B cells from Lupus－Prone NZB／W mice interact to generate IgM and IgG autoantibodies ［J］.Eur Immunol，2008，38 （3）：156－165.

［14］Patterson S，Chaidos A，Neville DC，et al.Human invariant NKT cells display alloreactivity instructed by invariant TCR－CD1dinteraction and killer Ig receptors ［J］.J Immunol，2008，181 （2）：3268－3276.

Effects of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus

LIU Tao，ZHAO Ling，ZHANG Yan－dong，WANG Kai，MA Ning，JIANG Zhen－yu
（Department of Rheumatology，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo explore the effect of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus（SLE）and to provide evidence for curing children with SLE.Methods30children with SLE and 30healthy children were selected.The levels of T cells，B cells，NK cells and NKT cells in peripheral blood were detected.The SLE patients were randomly divided into hormone therapy group （n＝15）and cyclophosphamide combined with hormone therapy group （n＝15），the changes of the levels of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment were detected by flow cytometry.ResultsCompared with healthy control group，the ratio of CD3＋CD4＋Th cells in SLE patient group was decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3＋CD8＋Tc cells was markedly increased （P＜0.05）；the ratios of CD3－（CD16CD56）＋NK and CD3＋（CD16CD56）＋NKT cells were decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was markedly increased（P＜0.01）.The ratio of CD3＋CD8＋Tc cells in peripheral blood of children with SLE was positively related to SLE DAI（r＝0.754 7，P＜0.01）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was also positively related to SLE DAI（r＝0.158 6，P＝0.029 3）.The ratios of Th，NK and NKT cells were not related to SLE DAI （P＞0.05）.Compared with before treatment，the ratio of CD3－CD19＋B cells was significantly decreased after treatment in hormone therapy group （P＜0.05），and the ratios of NK，NKT and Th cells were increased and the ratio of Tc cells was decreased，but there was no significant difference（P＞0.05）.In cyclophosphamide combined with hormone therapy group，the ratio of B cells was decreased after treatment，but the ratios of NK，NKT and Th cells were increased compared with before treatment（P＜0.01）.ConclusionThe imbalanced proportion of lymphocyte subsets in the children with SLE is involved in the pathogenesis of SLE，and the treatment of cyclophosphamide combined with hormone is more effective.

systematic lupus erythematosus；cyclophosphamide；lymphocyte subset；children

R593.24

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1168－05

2012－06－29

吉林省科技厅科研基金资助课题 （201115051）

刘 涛 （1980－），男，吉林省长春市人，医师，医学硕士，主要从事系统性红斑狼疮的研究。

姜振宇 （Tel：0431－88782060，E－mail：jlujzy＠yahoo.com.cn）