张 蓓，李亚军，张世俊，任会云，王敏娟，郭长江

（西安医学院附属医院神经内科，陕西 西安710077）

脑红蛋白在脑梗死大鼠脑组织中的表达及其神经保护作用机制

张 蓓，李亚军，张世俊，任会云，王敏娟，郭长江

（西安医学院附属医院神经内科，陕西 西安710077）

目的：观察脑梗死大鼠脑组织中脑红蛋白 （Ngb）的表达及其对PI3K／Akt信号通路的影响，探讨二者在缺血性脑损伤中的作用及Ngb神经保护作用的可能机制。方法：60只SD大鼠随机分为假手术组、缺血组、Hemin（Ngb诱导剂）组、LY （PI3－K／Akt抑制剂LY294002）组和Hemin＋LY组，每组12只。应用大脑中动脉线栓法制备脑梗死动物模型，术后24h观察各组大鼠神经功能评分和脑组织梗死体积；应用RT－PCR法检测各组大鼠脑组织Ngb mRNA表达水平及PI3－K／Akt活性。结果：假手术组未见TTC不着色区，未检出神经功能缺损。与缺血组比较，Hemin组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA表达水平升高 （P＜0.01），神经功能评分降低 （P＜0.05），脑梗死体积减小 （P＜0.01）；与缺血组比较，LY组大鼠脑梗死体积增加 （P＜0.01），神经功能评分升高 （P＜0.05），Akt mRNA表达水平降低 （P＜0.01），Ngb无明显变化。与 Hemin组比较，Hemin＋LY组大鼠脑组织损伤加重，Akt mRNA表达水平明显降低 （P＜0.01），Ngb未被抑制。结论：Ngb可以减小局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积，改善神经功能，并且可能通过PI3K／Akt信号通路发挥神经保护作用。

脑红蛋白；磷脂酰肌醇－3激酶／丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶；脑梗死

脑血管病是危害极大的常见病、多发病，目前尚缺乏切实有效的脑保护剂。脑红蛋白（neuroglobin，Ngb）是近年发现的一种主要表达于脑内神经元的携氧球蛋白。脑缺血缺氧时，Ngb在神经元中高度表达，并可作为一种内源性神经保护因子增强脑组织对缺血－缺氧损伤的耐受［1］，但其确切机制尚不明确，国内外罕见其信号通路的相关文献报道。氯化高铁血红蛋白 （Hemin）又名正铁血红素，临床上广泛应用于治疗贫血。Hemin在细胞和整体水平均能诱导神经细胞Ngb高表达［2－3］。本研究旨在进一步观察Ngb对脑梗死大鼠的神经保护作用，并探讨其是否通过激活磷脂酰肌醇－3 激 酶 （phosphoinositide－3kinase，PI3K）／丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶 （serine／threonine kinase，Akt）信号通路而实现；揭示这一保护作用的具体机制及可能涉及的信号转导途径不仅为开展Ngb的临床应用提供重要的理论依据，而且有可能为缺血性卒中甚至各种原因导致的缺氧性脑损伤带来全新的、可行的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠60只 （西安交通大学医学院实验动物中心提供），体质量 （280±20）g，随机平均分为假手术组、缺血组、Hemin组 （于术后1h腹腔注射Ngb诱导剂 Hemin 50mg·kg－1）、LY组 （PI3K／Akt抑制剂LY294002，0.3mg·kg－1于栓塞前15min经尾静脉给药）和Hemin＋LY组 （于相应时间点分别给予Hemin和LY294002），每组12只。

1.2 主要试剂 Trizol试剂盒 （Gibco公司），逆转录反应试剂盒 （Takara公司），PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（Takara公司），RNA提取试剂盒 （Tiangen公司），Hemin（上海丽珠生物技术有限公司），LY294002（Santa Cruz公司）。

1.3 动物模型制备 参照 Zea－longa法［4］改良后制作右侧大脑中动脉闭塞模型：大鼠经10%水合氯醛 （0.3mg·kg－1）腹腔注射麻醉后仰卧位固定，备皮，消毒，沿颈前正中线切开皮肤，逐层分离，暴露右侧颈总动脉 （CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉 （ICA），结扎ECA及CCA近心端，经CCA近分叉处切口插入线栓 （4－0单丝尼龙手术缝合线，头端加热成直径0.3mm光滑球形，酒精消毒、肝素浸泡后备用），进入ICA 18～20mm至大脑中动脉起始处，结扎固定线栓。假手术组仅分离暴露颈部动脉不阻断血流。

1.4 大鼠神经功能评定 术前及术后24h参照Zea－longa［4］标准进行神经功能评定。0分：无神经功能缺损；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧转圈；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自发行走，有意识障碍。1～4分视为造模成功，术前评分大于0分及术后评0分或术后24h内死亡者剔除，并随机补足。

1.5 大鼠脑梗死体积测定 每组各取6只大鼠于术后24h断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，以前囟 （Bregma）为标志点，从Bregma＋4.0mm～Bregma－8.0mm，以2mm间隔行连续冠状切片，共6片，放入1%红四氮唑 （TTC）磷酸盐缓冲液中 （pH ＝7.4），37℃孵育30min。正常大鼠脑组织着深红色，梗死灶呈苍白色。4%多聚甲醛固定，拍照，利用Photoshop等软件计算脑梗死体积。脑梗死体积计算公式：V＝t× （A1＋A2＋…An），V代表脑梗死体积，t代表脑片的厚度，A代表脑片的梗死面积。

1.6 RT－PCR方法检测大鼠脑组织中Ngb及Akt mRNA表达水平 每组动物各取6只，术后24h断头取脑，迅速置于液氮中保存备用。①基因引物：采用Primer 5.0软件设计PCR引物，由上海生工生物技术有限公司合成。Ngb上游序列，5′－AGCCGCAGCCCTCTGGAACA－3′，下游序列5′－GCAGCATCAATCACAAGCA－3′， 扩 增 长 度176bp；Akt 上 游 序 列，5′－CTGGCCAGGCCCAAGCACCG－3′，下 游 序 列，5′－CGTTCACTGTCCACACACTC－3′，扩增长度109bp；GAPDH 为 内 参 照，上 游 序 列，5′－ACCACCATGGAGAAGGCTGG－3′，下游序列，5′－CTCAGTGTAGCCCAGGATGC－3′，扩 增 长 度 为 528bp。②脑组织总RNA的提取：使用总RNA提取试剂盒，按其说明提取大鼠脑组织总RNA，并经紫外分光光度计定量。③RNA逆转录合成cDNA。④RT－PCR反应：94℃预变性2min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1.5min，共 28 个 循 环；72℃延伸7min。⑤采用紫外－凝胶成像分析系统（Alphalmager2200）记录电泳结果，采用Image J软件定量分析电泳结果。上述实验重复3次。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理。大鼠神经功能评分、脑组织Ngb及Akt mRNA的表达水平以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠死亡率比较 假手术组大鼠无死亡，缺血组和LY组各死亡2只，Hemin组死亡1只（术中损伤迷走神经迅速死于急性肺水肿），Hemin＋LY组死亡1只。以上大鼠不进入统计，另随机选取大鼠补齐。各组大鼠死亡率比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。

2.2 各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积 假手术组全部大鼠未检测到神经功能缺损 （0分），其余各组大鼠术后24h均有不同程度的神经功能缺损：Hemin组大鼠神经功能评分明显低于缺血组（P＜0.05），LY组大鼠神经功能评分高于缺血组（P＜0.05），Hemin＋LY组与缺血组大鼠神经功能评分比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。假手术组大鼠脑组织未见TTC不着色区，Hemin组脑梗死体积小于缺血组 （P＜0.01）。LY组脑梗死体积大于缺血组 （P＜0.01）；Hemin＋LY组脑梗死体积小于 LY 组 （P＜0.01），大于 Hemin组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

表1 各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积Tab.1 Neurological function score and cerebral infarction volume of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ischemia group ；△P＜0.01 vs Hemin group；＃P＜0.01 vs LY group.

Group Neurological scoreCerebral infarction volume（V／mm3）eration 0 0 Ischemia 2.98±0.76 179.50±3.94 Hemin 2.13±0.54＊ 86.67±5.89＊＊LY 3.42±1.01＊ 225.00±3.46＊＊Hemin＋LY 2.87±0.62△＃ 188.67±2.42＊△＃Sham op

2.3 各组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA的表达水平 假手术组大鼠脑组织Ngb mRNA仅有少量表达。与假手术组比较，缺血组大鼠脑组织中Ngb mRNA表达水平明显增高 （P＜0.01），但Akt mRNA表达水平降低 （P＜0.01）。与缺血组比较，Hemin组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA表达水平均升高 （P＜0.01）；LY组Akt mRNA表达水平降低 （P＜0.01），Ngb mRNA无明显变化（P＞0.05）；Hemin＋LY组Ngb mRNA被诱导高表达 （P＜0.01），Akt mRNA表达水平降低（P＜0.05）。与Hemin组比较，Hemin＋LY组大鼠脑组织中Akt mRNA表达水平明显降低 （P＜0.01），Ngb mRNA表达水平两组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。与LY组比较，Hemin＋LY组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA均在Hemin诱导下表达水平升高 （P＜0.01）。见图1和表2。

图1 各组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groupsLane 1：Sham operation group；Lane 2：Ischemia group；Lane 3：Hemin group；Lane 4：LY group；Lane 5：Hemin＋LY group.

表2 RT－PCR检测各组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA表达水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

表2 RT－PCR检测各组大鼠脑组织中Ngb和Akt mRNA表达水平Tab.2 RT－PCR analysis of expression levels of Ngb and Akt mRNA in brain tissue of rats in various groups（n＝6，±s）

＊P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs ischemia group；＃P＜0.01 vs Hemin group；○P＜0.01 vs LY group.

eration 1.18±0.07 0.28±0.04 Ischemia 0.90±0.01＊ 0.46±0.02＊Hemin 1.02±0.07△△ 1.03±0.00△△LY 0.47±0.02△△ 0.44±0.03 Hemin＋LY 0.80±0.05△＃○ 0.89±0.05 b mRNA Sham op Group Expression of Akt mRNA Expression of Ng△△○

3 讨 论

脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点，是老年人致死和致残的重要原因。选择有效靶点、改善缺血部位对缺血缺氧的耐受性、延长缺血组织和细胞发生不可逆损伤前的时间是目前治疗缺血性脑血管病亟需解决的问题。

Ngb是2000年由德国科学家Burmester等［5］首先报道的、主要存在于脊椎动物脑内的一种新的携氧珠蛋白，其与氧具有很高的亲和力，并可以与氧可逆地结合，协助氧透过血脑屏障，增加代谢活跃的神经组织的氧供。在脑缺血缺氧、氧化应激和毒物损伤等病理情况下，Ngb的表达均有不同程度的增加。Ngb神经保护作用的确切机制尚不清楚，研究［6－9］发现：Hgb可能通过储存氧和协助氧在细胞内向线粒体扩散、清除活性氧自由基和氮自由基及作为信号转导中的调节子调节一个G－蛋白偶联的信号转导通路这3条途径发挥作用。

本实验结果显示：在缺血前腹腔注射Hemin可上调大鼠脑组织中Ngb mRNA表达水平，同时Hemin组动物脑缺血后神经功能评分、脑梗死体积均较缺血组有明显改善，进一步证实了Ngb对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用，而且Hemin能诱导Ngb表达增加从而减轻脑损伤。Hemin调控Ngb表达的机制尚不十分清楚，可能由可溶性鸟氨酸环化酶－蛋白激酶G通路介导［2］，但是否还存在其他机制有待于进一步研究。

PI3K／Akt信号途径是脑缺血后与细胞损伤有关的重要的信号转导通路，参与了脑缺血的病理过程，且与脑缺血损伤程度有关。多种神经营养因子通过激活PI3K／Akt信号通路抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用［10］。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，激活后在质膜上产生第二信使PIP3，进一步引起信号蛋白Akt活化。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游效应分子的激活，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等，故Akt作为PI3K下游的直接靶蛋白，可反映PI3K／Akt信号通路的活性变化。LY294002是目前应用较广泛的PI3K／Akt特异性抑制剂，通过特异性抑制PI3K p110亚单位的催化活性，阻碍下游底物PIP3的产生，使该通路处于失活状态。

本实验结果显示：栓塞前给予特异性PI3K／Akt通路阻断剂LY294002不仅增大了大鼠脑梗死体积、加重了神经功能缺损，而且抑制了Akt mRNA表达水平，但Ngb的表达与缺血组比较无差异；而在Ngb诱导剂Hemin的干预下，Akt mRNA的表达和Ngb均升高，大鼠脑组织损伤亦同时减轻，从而推断脑梗死大鼠Ngb可能通过激活PI3K／Akt信号通路发挥脑保护作用。缺血组大鼠脑组织Akt mRNA表达较假手术组降低，与缺血后Ngb的变化趋势不同，这与Zhao等［11］的报道一致，考虑与脑梗死24h缺血半暗带内PI3K／Akt细胞信号几乎衰竭及其促细胞存活生物学效应减弱有关，亦提示PI3K／Akt信号通路参与了脑梗死大鼠脑组织损伤过程。LY294002通过竞争性结合PI3K的ATP结合位点，阻断PIP3的产生，进而抑制Akt的磷酸化以抑制PI3K／Akt信号通路的活性，理论上对Akt mRNA表达水平干预作用甚小。本实验结果与张继红等［12］和朱建峰等［13］的研究结果一致，考虑可能与实验条件、样本量和反馈调节机制等有关。本研究仅从基因水平对Ngb的脑保护作用机制进行了初步探讨，证实了PI3K／Akt通路可能介导了脑缺血后Ngb的神经保护作用，但尚需进一步从蛋白水平进行验证。

［1］Yu Z，Liu N，Liu J，et al.Neuroglobin，a novel target for endogenous neuro－protection against stroke and neurodegenerative disorders ［J］.Int J Mol Sci，2012，13 （6）：6995－7014.

［2］Zhu Y，Sun Y，Jin K，et al.Hemin induces neuroglobin expression in neural cells［J］.Blood，2002，100（7）：2494－2498.

［3］刘 娟，姚国恩，蒋晓江，等.氯化血红素对大鼠局灶性脑缺血组织的作用探讨 ［J］.第三军医大学学报，2006，28 （10）：1035－1037.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［5］Burmester T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin expressed in the brain ［J］. Nature，2000，407 （6803）：520－523.

［6］Hota KB，Hota SK，Srivastava RB，et al.Neuroglobin regulates hypoxic response of neuronal cells through Hif－1α and Nrf2－mediated mechanism ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，32 （6）：1046－1060.

［7］De Marinis E， Ascenzi P， Pellegrini M，et al.17βestradiol－－a new modulator of neuroglobin levels in neurons：role in neuroprotection against H2O2－induced toxicity ［J］.Neurosignals，2010，18 （4）：223－235.

［8］Watanabe S，Takahashi N，Uchida H，et al. Human neuroglobin functions as an oxidative stress－responsive sensor for neuroprotection ［J］. J Biol Chem， 2012，287 （36）：30128－30138.

［9］Li RC，Morris MW，Lee SK，et al.Neuroglobin protects PC12cells against oxidative stress ［J］.Brain Res，2008，1190 （3）：159－166.

［10］Nayak GH，Prentice HM， Milton SL. Neuroprotective signaling pathways are modulated by adenosine in the anoxia tolerant turtle ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2011，31 （2）：467－475.

［11］Zhao H，Shimohata T，Wang JQ，et al.Akt contributes to neuroprotection by hypothermia against cerebral ischemia in Rats［J］.Neuroscience，2005，25 （42）：9794－9806.

［12］张继红，王 红，任立群，等.血管生成素2经PI3K／Akt途径对HCT－8细胞增殖的促进作用 ［J］.吉林大学学报：医学版，2011，37 （6）：1057－1061.

［13］朱建峰，秦 俭，赵 倩，等.重组人促红细胞生成素对缺血后处理大鼠心脏保护作用及对PI3K／Akt信号通路的影响 ［J］.重庆医科大学学报，2011，36（7）：822－825.

Expression of neuroglobin in brain tissue of rats with cerebral infarction and its neuroprotective mechanisms

ZHANG Bei，LI Ya－jun，ZHANG Shi－jun，REN Hui－yun，WANG Min－juan，GUO Chang－jiang
（Department of Neurology，Affiliated Hospital，Xi’an Medical University，Xi’an 710077，China）

ObjectiveTo observe the expression of neuroglobin （Ngb）in brain tissue of rats with cerebral infarction and its effect on PI3－K／Akt signaling pathway，and to study their effects on cerebral ischemic injury and the possible mechanisms of the neuroprotective effect of Ngb.Methods60SD rats were randomly divided into sham operation group，ischemia group，and Hemin group，LY group，and Hemin＋LY group，and there were 12rats in each group.Cerebral infarction models were established by middle cerebral artery thread embolism method.All rats were sacrificed 24hafter operation for neurological evaluation and detection of cerebral infarction volume，and the expression levels of Ngb and Akt mRNA were detected by RT－PCR.ResultsThere was not any area unstained by triphenyltetrazolium chloride and any neurologic impairment found in rats in sham operation group.Compared with ischemia group，the expression levels of Ngb and Akt mRNA in Hemin group were increased significantly （P＜0.01），with better neurological function （P＜0.05）and less volume of cerebral infarction （P＜0.01）.The volume of cerebral infarction （P＜0.01）and the neurological impairments（P＜0.05）in LY group were increased，and the expression level of Akt mRNA in LY group was lower（P＜0.01）than that in ischemia group，and there was no significant difference in the expression of Ngb（P＞0.05）.The cerebral tissue damage in Hemin＋LY group was aggrevated，and the expression level of Akt mRNA was decreased（P＜0.01），while the level of Ngb mRNA was not inhibited by LY294002（P＞0.05）compared with Hemin group.ConclusionNgb can reduce the volume of cerebral infarction and improve neurological function after focal cerebral ischemia in rats and its neuroprotective effect may be realized by activating PI3－K／Akt signaling pathway.

neuroglobin；phosphoinositide－3kinase／serine－threonine kinase；cerebral infarction

R743.33

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1114－05

2012－07－26

陕西省自然科学基金资助课题 （2010JM4054）；陕西省教育厅科研基金资助课题 （09JK713）

张 蓓 （1980－），女，山东省济宁市人，主治医师，讲师，在读医学博士，主要从事脑血管病发病机制的研究。

李亚军 （Tel：029－84277893，E－mail：liyajun9＠hotmail.com）