陈平，谭龙涛，喻春明，王延周，陈继康，熊和平

(中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205)

苎麻(Boehmeria nivea L.Gand)为荨麻科苎麻属多年生宿根性草本植物，是我国特色的韧皮纤维作物。苎麻经收获剥制干燥得到原麻，从原麻及脱胶后精干麻外观无法区分不同的品种。要对苎麻原麻进行品种溯源和转基因检测，首先要提取原麻的DNA。苎麻DNA的提取，都是以幼嫩叶片或种子为试材［1－3］，目前还未见有关从苎麻原麻中提取DNA的报道。由于苎麻含有多糖、多酚及其它次生代谢产物，陈年原麻中DNA随着存放时间的延长而降解严重，用常规CTAB法很难提取出DNA。本试验参照中药材DNA提取的方法［4－6］，采取延长提取时间、加多种抗氧化剂和除蛋白的方法对苎麻陈年原麻基因组DNA提取进行了研究，并对提取产物进行了分光光度、琼脂糖凝胶电泳及PCR检测，为苎麻原麻DNA提取及转基因检测寻找了一条有效的途径。

1 材料与方法

1.1 植物材料与试剂

植物材料为2005年和2010年采集的苎麻品种“中苎一号”头麻的原麻，试验在2011年7月进行。

CTAB 提取液:质量浓度为 2%CTAB(Cetyltriammonium bromide)，1.4mol/L NaCl，100mmol Tris－HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA，质量浓度为3%PVP，3%β － 巯基乙醇。

PCR所用的Taq DNA聚合酶、dNTP等均购于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

具体方法如下:取先用无菌水浸泡过的苎麻原麻0.5g(剪成小块利于研磨)，迅速放入液氮，迅速研磨成粉末。再加入0.5ml 2%CTAB提取液(预热至55℃)，然后55℃水浴1h左右，期间多次振荡离心管，再放入4℃冰箱中过夜提取。第二天加入0.5ml(24:1)氯仿/异戊醇，4℃12000r/min离心10min，小心吸取上清液并转入另一个灭菌1.5ml离心管中，加入300ul 10mol/L NH4AC和600ul异丙醇放置在－20℃下沉淀5h，然后4℃下12000r/min离心10min，弃液相，用70%乙醇清洗DNA 1－2次，将DNA沉淀自然风干，然后加200ul TE溶解备用。

1.2.1 DNA纯度及完整性测定

以λ/HindⅢ作为分子量参照物，用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。用紫外线分光光度计测定所提取DNA溶液的OD260和OD280，测3次取平均值，算得A260/A280。根据OD260值按照1个OD260nm值相当于50ng/ul和稀释倍数来换算DNA的浓度，并计算DNA的产量。

1.2.2 DNA的PCR鉴定

PCR扩增引物CL是根据苎麻木质素合成相关基因4CL基因序列设计，序列为:前引物5＇－AGGATACAAGAGGAGGGAAGAG －3＇，后引物:5＇－ ATACGGTCAACCACGTAAAGAT －3＇。

PCR 扩增采用20ul反应体系，体系包括 DNA 模板 2ul、引物 1ul、dNTPs(2.5mM each)2ul、10×Tag buffer(含 Mg+)2ul、Taq －DNA 聚合酶(5U)0.3ul，加 ddH2O 至20ul。

PCR 反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，34个扩增循环，最后72℃延伸5min。

2 结果与分析

2.1 DNA纯度和产量

从表1可以看出，提取的2010年和2005年苎麻原麻DNA的D260/D280都在1.8－2.0之间。但保存时间不同的原麻DNA产率有差异，2010年原麻提取的DNA浓度明显高于2005年原麻，而且2010年原麻的产率高于2005年原麻的产量。原因可能是随着保存年份的增加，原麻中的DNA逐渐发生降解，另外样本液中蛋白质、多糖和酚类等杂质污染，导致DNA纯度和产量发生变化。

2.2 DNA的电泳检测

对所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，从图1中可以看出，四个样品提取的DNA都有条带，但2010年原麻提取DNA的条带明显比2005年原麻的清晰。说明苎麻原麻经过机械剥制和长时间保存，DNA发生了部分降解，含量较低。

2.3 PCR扩增反应

将提取DNA作为模板进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明(图2)，2010年和2005年原麻提取的DNA均可扩增出清晰谱带。说明虽然从苎麻陈年原麻中提取的DNA的浓度较低，但是能够满足PCR分析的要求。

图2 苎麻原麻提取DNA的PCR鉴定Fig.2 PCR amplification of 4CL gene of ramie

3 讨论

苎麻原麻中含有大量的多糖、多酚等次生代谢物质，而且越老，这些物质含量就越高。尤其是多糖，可与DNA同时沉淀，使DNA提取物呈胶状，从而影响对DNA样品的浓缩，干扰后续操作。因此大多数试验都是以苎麻幼嫩叶片为材料，但幼嫩部位材料的采集会受到季节限制。我们尝试过用常规CTAB法提取原麻基因组DNA，但结果不理想。本研究在传统CTAB提取方法的基础上，采取延长提取时间、加多种抗氧化剂和蛋白分离的方法对苎麻基因组DNA进行提取。分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，2010年原麻提取出的DNA产量和纯度、产量均高于2005年原麻，说明苎麻原麻基因组DNA随着存放时间的延长而出现降解，存放时间越长，提取难度越大。PCR检测表明存放6年的苎麻原麻仍能够提取出DNA，虽然提取的DNA浓度较低，但PCR条带较亮，能够满足分子检测的需要。此提取方法可很好的解决苎麻嫩叶取材的时间限制，保证试验的顺利进行，同时为陈年原麻品种溯源和转基因检测提供了有效的方法。

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