刘虹，韩芳，石玉秀

（中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳110001）

创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指突发的巨大灾难（战争、地震等）或严重威胁的生活事件导致长期持续存在的精神障碍［1］。临床表现为记忆异常、焦虑、恐惧增强等精神症状［2，3］。海马是边缘系统中学习、记忆的重要部位［4］，还是应激反应的调节中枢。我们前期的研究证实PTSD时杏仁核神经元钙超载［5］。海马与杏仁核都属于边缘系统，而且相互联系、相互影响。本实验进一步研究PTSD时海马神经元Ca2+浓度的变化。内质网是细胞加工蛋白质和贮存Ca2+的主要场所，对应激极为敏感。钙网蛋白（calreticulin，CRT）主要存在于内质网，是调节细胞内Ca2+稳态和协助蛋白质正确折叠的伴侣蛋白。检测分子伴侣CRT在PTSD大鼠海马神经元的表达变化，探讨CRT对PTSD大鼠海马神经元内Ca2+信号的调节，为研究PTSD海马记忆异常的发病机制提供依据。本研究采用国际公认的单一延长应激（single-prolonged stress，SPS）方法制备PTSD动物模型，用免疫组织化学、免疫印迹和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测大鼠海马神经元分子伴侣CRT在PTSD内质网应激的表达变化，用荧光探针标记法检测大鼠海马神经细胞内游离Ca2+浓度变化，为揭示PTSD所致的记忆异常的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性Wistar大鼠（购于中国医科大学实验动物中心），体质量150～180 g，12 h光亮/黑暗条件、温度22～25℃，常规喂养，自由摄食饮水。随机分为SPS1 d、4 d、7 d组及正常对照组，每组5只。

1.2 SPS模型的建立

采用国际公认PTSD动物模型制备方法［6］——SPS。SPS具体步骤：大鼠禁锢2 h后，强迫游泳20 min（水深 40 cm，水温25℃），休息15 min后，乙醚麻醉至意识丧失。麻醉后将大鼠置于通风处至自然苏醒，无干扰喂养，常规饮食直至取材。

1.3 光镜标本制备

大鼠经0.4%戊巴比妥麻醉后，4%多聚甲醛心脏灌流，取材，续固定3 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm。

1.4 CRT的免疫组织化学染色

切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐微波修复，采用SABC法，各步骤间均用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。主要步骤：（1）0.3%TritonX-100室温10 min；（2）3%H2O2室温孵育10 min；（3）5%BSA 室温20 min；（4）一抗 4 ℃过夜，兔多克隆抗体 CRT（英国Abcam 公司，1∶500）；（5）二抗及 SABC（SABC 试剂盒，武汉博士德公司）均37℃孵育20 min；（6）DAB显色10 min，蒸馏水冲洗数分钟，常规脱水，透明，中性树胶封片。免疫反应对照组用0.01 mol/L PBS代替一抗，其他步骤同上。光学显微镜（80i，日本Nikon公司）下观察，摄片。

1.5 CRT的免疫印迹法检测

大鼠处死后断头取脑，冰上快速分离海马，加入裂解液，提取蛋白，考马斯亮蓝法定量后，SDS-PAGE电泳，PVDF膜电转印，封闭，一抗兔多克隆抗体CRT（英国Abcam公司，1∶1000）和小鼠单克隆抗体GAPDH（北京中杉金桥，1∶1000）4℃过夜，辣根过氧化物酶标记二抗（北京中杉金桥，1∶2000）室温孵育1 h，ECL显色。利用天能GIS凝胶成像系统进行分析，以目的条带与内参照GAPDH的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

1.6 CRT的RT-PCR检测

大鼠处死后断头取脑，冰上快速分离海马，利用Trizol试剂提取总RNA。分光光度计定量后，进行逆转录和PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术公司合成，CRT的引物序列：上游5′-CAAGGATATCC GGTGTAAGGA-3′，下 游5′-CATAGATATTCGCAT CGGGG-3′；β-actin 的引物序列：上游5′-GTCACCCA CACTGTGCCCATC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCG CTCAGGAG-3′。CRTPCR 扩增条件：94 ℃5 min，94℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 个循环，72 ℃10 min；β-actinPCR 扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，58℃30 s，72℃30 s，30个循环，72℃8 min。扩增结束后取5 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用天能GIS凝胶成像系统进行观察拍照并进行积分光密度分析，以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

1.7 海马细胞游离Ca2+浓度测定

大鼠处死后断头取脑，冰上快速分离海马，制备1×l06～1×107/mL的细胞悬液，经台盼蓝排斥实验检查细胞成活率达95%以上后，加入2.5 μL预冷的Fura-2/AM（美国Sigma公司）37℃水浴箱避光孵育40 min；荧光分光光度计（F-4500，日本 HITACHI公司）检测，发射波长为500 nm，激发波长为340 nm和380 nm。测定时依次记录静息、加入10%TritonX-100和0.3%EDTA后340 nm与380 nm的荧光比值，利用公式计算出细胞内游离Ca2+含量，细胞内游离Ca2+含量（nmol/L）=Kd（R-Rmin）F0/（Rmax-R）Fs。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 海马神经元CRT的免疫组织化学染色结果

CRT阳性表达主要位于胞质。正常对照组（图1A）大鼠海马阳性细胞少。SPS1d组CRT的表达增多（图1B），SPS 7 d组表达最多（图1C）。

2.2 海马CRT的免疫印迹结果

CRT和GAPDH的分子量分别为64和36 kDa，条带清晰（图2A）。以GAPDH的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值进行校正和半定量分析。SPS1d、4 d、7 d组与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05，图2B），SPS 7 d 组海马 CRT的表达最多。

2.3 海马CRT的RT-PCR结果

PCR结果（图3A）显示，正常对照组大鼠海马中CRTmRNA 均有一定的表达，SPS1d、4 d、7 d 组与正常对照组比较差异有统计学差异（P<0.05，图3B），SPS 7 d组海马CRT的表达最多。

2.4 海马细胞内游离Ca2+检测

SPS1d、4 d、7 d组和正常对照组海马细胞内游离 Ca2+浓度分别为（390.335±9.917）、（360.138±9.411）、（336.304±7.413）和（301.534±5.725）nmol/L。SPS1d组大鼠海马细胞内游离Ca2+浓度增至顶峰，之后逐渐下降。

3 讨论

PTSD是指由于灾害、战争、交通意外等异常威胁性或灾难性心理创伤导致出现长期持续性精神障碍，其临床表现以再度体验创伤为特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为。简而言之，PTSD是一种创伤后心理失衡状态［15，16］。海马是负责学习和记忆的重要脑区，是调节应激反应并受应激影响的敏感区。内质网是细胞内重要的细胞器，是调节蛋白质合成及合成后正确折叠的场所，也是调节细胞的应激反应及储存Ca2+的场所。CRT是内质网中主要的Ca2+结合蛋白，具有特殊的功能结构域［7，8］，由高度保守的N区、富含脯氨酸的P区和酸性的C区构成。其中C区具有高容量的Ca2+结合位点，有很强的与Ca2+结合的能力，参与内质网中Ca2+的存储，调节胞质内Ca2+平衡，从而在机体钙平衡中发挥重要作用。

本实验研究结果表明PTSD海马神经元内游离Ca2+浓度增高，为减轻胞质 Ca2+超载［9］，CRT 表达上调。另外CRT作为分子伴侣参与处理未折叠蛋白反应［10］，减轻错误折叠蛋白和未折叠蛋白在内质网腔的聚积。CRT的C末端存在内质网滞留信号序列KDEL，确保滞留在内质网中的错误折叠蛋白进行正确折叠，并转运至高尔基体［11，12］。Molinari等［13］证实，CRT缺陷的细胞系其蛋白质折叠正确性大大降低。PTSD导致内质网应激，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，激活未折叠蛋白反应。本实验结果显示，CRT表达上调，协助处理未折叠蛋白反应。过强的应激可使内质网自稳功能受损，诱导内质网路径细胞凋亡［17］。另外 Okunaga等［14］的研究表明CRT过表达改变Ca2+稳态上调PP2A表达，抑制Akt信号转导途径，促进分化依赖性细胞凋亡。本研究揭示了分子伴侣CRT在PTSD大鼠海马神经元内质网应激的调控作用。PTSD导致海马神经元内质网应激、钙超载、CRT表达上调，引发细胞凋亡，也为解释PTSD学习和记忆功能异常的发病机制提供依据。

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