杜雪纯，徐毅敏，季 申，毛秀红，王 柯，王书芳

(1.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058;2.上海市食品药品检验所，上海 201203)

白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，具有补血调经、养阴平肝、柔肝止痛、敛阴止汗之功效。研究表明，白芍还具有抗炎、抗病毒、解痉镇痛、护肝等多种药理活性［1-3］。然而，白芍生长和储存过程中易感染根腐病、锈病、灰霉病等，且易受地下虫害的侵害，而多菌灵、托布津等多种农药常被用于白芍的病虫害防治［4-6］，因此有可能造成白芍的农药残留，而残留的农药被人体吸收易产生严重危害。已有报道，采用气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)来测定白芍中的有机氯、有机磷及除虫菊酯类农药［7-13］。毛细管电泳(CE)方法因分析时间短，分离效率高，且对样品和溶剂消耗量少，已越来越多地被用于中药材中的农药残留的测定［14］。GC法适用于检测挥发性较好的农药。因GC、HPLC和CE方法分离原理及适用分析对象不同，三者在农药残留分析方面可相互补充。采用质谱(MS)检测方法可提高CE分析灵敏度与选择性，并能提供分析物的结构信息［15］。因此，本研究拟建立白芍中19种有机氮类农药残留的CE-MS检测方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent G1601 HP3D毛细管电泳仪与单重四级杆HP Series 1100 MSD质谱仪(配电喷雾离子源)通过CE-MS喷雾组件连接，质谱接口为同轴鞘液接口(美国安捷伦科技公司)，鞘流液通过1100等梯度泵和1∶100分流器提供(美国安捷伦公司)。熔融石英毛细管柱70 cm ×50 μm(美国 Polymicro Technologies公司)。数据处理使用安捷伦公司的工作站软件完成。

1.2 试剂与药材 农药标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度均大于97.0%;乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merck公司);甲酸(美国TEDIA公司)为色谱纯;无水硫酸镁(美国Sigma公司，650℃干燥5 h，干燥器储存)为分析纯;Milli-Q纯化水(美国Millipore公司);N-丙基乙二胺填料(PSA，美国Varian公司);50 ml离心管(墨西哥Corning公司)。24批白芍药材分别购自浙江省、河南省、四川省、吉林省和山西省，经浙江大学药学院陈柳蓉老师鉴定为毛茛科植物芍药的根。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 取干燥白芍药材粉末(过孔径200 μm 筛)5 g，精密称定于50 ml离心管中，加入乙腈20 ml，无水 MgSO41 g，旋涡混合1 min，超声提取20 min，20℃ 4 000 r/min离心10 min，取上清液;再加入10 ml乙腈至离心管中，重复上述操作。合并上清液后，加入60 mg PSA和180 mg无水MgSO4，旋涡混合1 min，20℃ 4 000 r/min 离心 10 min，取上清液，残渣再加5 ml乙腈，重复上述操作。合并上清液，40℃旋转蒸发仪蒸干，残渣用0.5 ml甲醇溶解，20℃ 10 000 r/min高速离心10 min，取上清液，用于CE-MS分析。

2.2 标准品储备液的配制 准确称取19种农药对照品适量，分别置5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，振摇，制得 0.204 mg·ml-1～2.74 mg·ml-1标准品储备液。

2.3 CE-MS 条件

2.3.1 电泳条件 熔融石英毛细管柱70 cm×50 μm，运行缓冲液为1%甲酸-15%甲醇水溶液(V/V);毛细管温度为25℃，分离电压为20 kV。毛细管首次使用时，依次用1 mol·L-1氢氧化钠溶液、水和运行缓冲液各冲洗10 min。每次进样前用运行缓冲液冲洗平衡5 min，并且每2次分析之间，毛细管依次用水冲洗1 min，0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液冲洗 2 min，水冲洗2 min。为保证良好的重现性，每3次分析之后换用新的缓冲液。压力进样:50 mbar，进样时间20 s。

2.3.2 质谱条件 90%甲醇-0.2%甲酸溶液为鞘液，流速为8μL·min-1;采用电喷雾离子化源(ESI)，正离子模式检测。碎片离子电压100 V，毛细管电压为5 000 V。雾化气体压力5 psig，干燥气体流速 6 L·min-1，干燥温度250℃。选择离子监控模式(SIM)用于定量分析，用于定量分析的SIM离子见表1。

3 结果与讨论

3.1 电泳条件优化 预实验表明，采用甲酸-甲醇的水溶液作为缓冲体系，能够在较短的时间内达到基线分离，且峰形较好。在此基础上分别对缓冲液中甲酸和甲醇含量进行优化。

3.1.1 缓冲液中甲酸含量 本实验考察了缓冲液中甲酸浓度变化(0.5% ～3.0%)对样品分离的影响。结果表明，在其它条件不变的情况下，当甲酸从0.5%到1%时，响应逐渐增高且分离效果良好;但当甲酸比例继续增加时，响应增高，分离度却变差。综合考虑被测物的分离度和响应，选择1%甲酸。

3.1.2 缓冲液中甲醇含量 本实验考察了缓冲液中甲醇浓度(5%、10%、15% 和20%)对分离效果的影响。结果表明，当体系中含15%甲醇时，灵敏度最高，峰形最好，故选用含有15%甲醇的缓冲体系。

最终，本实验电泳缓冲液选择1%甲酸-15%甲醇水溶液。

3.2 质谱条件的优化

3.2.1 鞘液组成及流速 本实验对鞘液中的甲醇及甲酸的浓度进行优化以获得最佳分离效果和MS响应。固定鞘液组成中甲酸浓度为0.1%，当甲醇浓度改变为90%时，峰形好，且响应值较高。然后，对90%的甲醇-水鞘液中甲酸浓度进行优化，实验结果显示，添加0.2%甲酸时，MS响应值高。鞘液中甲醇比例对峰面积和峰高的影响见图1。

实验同时还考察了鞘液流速对分离和响应的影响，结果表明，当鞘液流速为8μL·min-1时，样品响应与6μL·min-1时的样品响应相差不大，而分离度和峰形都明显优于6μL·min-1时，故最终选择鞘液流速为8μL·min-1。

图1 鞘液中甲醇浓度对峰高(A)和峰面积(B)的影响Fig.1 The effect of methanol concentration in sheath liquid on the peak height(A)and peak area(B)

3.2.2 其它质谱参数 分别考察了喷雾气压力、干燥气流速、干燥气温度、毛细管电压和碎片离子电压的影响，最后选择喷雾气压力为5 psig，干燥气流速为6 L·min-1，干燥气温度为250℃，毛细管电压为5 000 V，碎片离子电压为100 V。

3.3 线性关系考察 分别准确量取19种农药标准品储备液适量，加甲醇稀释成10个质量浓度的系列标准品混合溶液。在上述确定的实验条件下进样测定，以定量离子的峰面积为纵坐标(Y)，标准品质量浓度(mg·L-1)为横坐标(X)进行线性回归。各对照品的回归方程及检测限(LOD，S/N=3)见表1。混合标准品溶液、加入混合标准品溶液的白芍样品溶液和白芍空白样品溶液的总离子流及选择离子流电泳图见图2，除乙氧喹啉、螺环菌胺和灭菌唑因同分异构体出现2个峰外，其它标准品均为单一色谱峰。

3.4 准确度和重复性实验 取混合对照品溶液，连续进样6次，测得峰面积，19种农药峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.7% ～8.4%(n=6)，进样精密度良好。

精密称取干燥白芍药材粉末5 g，分别加入质量浓度为 0.01 mg·kg-1和 0.10 mg·kg-1的混合标准品溶液，每个添加水平平行6份，按“2.1”项下方法制备加样回收率供试液，按“2.3”项下仪器条件进行CE-MS分析，计算各农药回收率及RSD(表2)，以考察方法的准确度和重复性。各农药的平均回收率为80.1%～108.4%，RSD ＜20%(除螺环菌胺为22.3%，乙氧喹啉为 29.2%外)。

3.5 样本测定 精密称取24批白芍药材粉末各5 g，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，“2.3”项下仪器条件进行分析，测定19种农药的残留量，结果各产地白芍药材均未检测出农药。

表1 19种农药的线性结果和检测限Table 1 The linearity results and LODs for 19 pesticides

图2 混合标准品、加入混合标准品的白芍样品和空白样品溶液的总离子流及其选择离子流电泳图Fig.2 The typical TIC and EIC electropherograms of standards mixture，Paeoniae Radix Alba sample spiked with the 19 pesticides，and blank Paeoniae Radix Alba sample

表2 白芍中各农药的回收率Table 2 The recoveries of the 19 pesticides in Paeoniae Radix Alba matrix(n=6)

4 结论

本研究建立了白芍药材中19种有机氮类农药残留的CE-MS检测方法。结果表明，该方法适用于白芍中有机氮类农药检测，并可为其它中药材中的有机氮类农药检测提供参考。

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