胡金辉，周 青，黄艳茹，莫兴群

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

前列腺增生症即良性前列腺增生(BPH)，临床以下尿路症状或下尿路症状加重以及尿路受损为主要表现，部分存在膀胱出口梗阻［1］。随着社会老龄化，BPH 已成为影响男性健康的常见病、多发病；男性前列腺在青中年时开始出现不同程度组织学增大，随年龄增长前列腺增生体积呈上升趋势，而在85 岁以上患者中前列腺总体积增大高达90%［2-3］。良性前列腺增生是由基质和上皮依不同比例混合增生的疾病，且以基质增生为主，年龄越大，增生的基质越多，上皮组织越少[4]。因此，对前列腺基质细胞进行研究具有重要意义。有学者研究发现前列腺内生长因子 TGF-/bFGF 是前列腺增生的重要直接诱因之一［5］，本实验旨在探讨前癃通胶囊对细胞分泌的TGF-β1mRNA 表达的影响；采用MTT 比色法检测前癃通胶囊对体外培养良性前列腺增生前列腺基质细胞增殖的抑制作用；同时应用逆转录-多酶链反应（RT-PCR）技术，观察前癃通胶囊干预下TGF-β1mRNA 在良性前列腺增生基质细胞中的表达的变化，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法[6]

1.1 材料

1.1.1 药物 前癃通胶囊：由黄芪、田三七、水蛭、丹参、穿山甲、王不留行等药物精制而成(由湖南中医学院附属一医院制剂室制成胶囊)，取前癃通胶囊粉末20 g，溶于20 mL 含血清培养液含生药量6.6 g/mL，再经过滤器过滤。

1.1.2 试剂 MTT （溴化二甲基噻唑二苯四氮唑）、DMSO （二甲基亚砜） 及胰酶均为美国Sigma 公司；1640 培养液（含双抗）、PBH(磷酸缓冲液)、胎牛血清及冰醋酸均购自北京鼎盛生物工程有限公司; 良性前列腺增生原代基质细胞购于上海拜力生物技术公司；总RNA 提取试剂盒（博大科技生物公司）。

1.1.3 仪器 CO2恒温培养箱(SHELLAB 公司)；984型低温冰箱（Forma 公司）；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；相差倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；全自动酶标仪（BIORAD 公司）；离心机（美国Beckman公司）；电泳仪（北京六一公司）；琼脂糖凝胶电泳槽（北京六一公司）；核酸蛋白分析仪 （德国eppendor公司）；培养板、培养瓶（日本Nuco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将良性前列腺增生原代基质细胞消化到12 个96 孔板，然后按随机数字表法随机分成3组，即24、48、72 h 组，贴壁生长后予以药物处理。

1.2.2 给药剂量及方法 96 孔板上分设空白、高浓度、中浓度、低浓度组，每个浓度组重复5 次，分别给以细胞培养液、前癃通胶囊 （药液） 浓度为10、1、0.1 mg/mL，每孔加入100 μL 成细胞悬液，24 h 换液1 次。分别于培养24、48、72 h 后，用注射器吸掉孔内液体，每孔加入100 μL DMSO 混合液，室温下振荡5 min。

1.2.3 细胞增殖抑制率的检测 全自动酶标仪上于450 nm 波长下检测，检测24、48、72 h 点的各浓度细胞吸光值A，按照公式：细胞增殖抑制率%=1-(试验孔A 值-细胞空白组A 值/药物空白组A 值-细胞空白组A 值)×100%，计算出细胞增殖抑制率OD。

1.2.4 RT-PCR 扩增法 （1）分组 将12 瓶长满瓶底70%的细胞按随机数字表法随机分成4 组，空白组：给予细胞完全培养液，前癃通胶囊高、中、低浓度组分别给予100、50、25 mg/mL，24 h 换液1 次每瓶加5 mL，连续给药84 h。（2）检测指标 连续给药84 h 后提取各样本细胞的RNA，经核酸蛋白分析仪测RNA 的浓度和纯度，分析TGF-β1 在BPH 中的表达量。

1.4 统计学分析

所有资料均经SPSS 16.0 统计软件进行统计分析，计量资料用“±s”表示，采用重复测量资料的方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度前癃通胶囊对体外培养基质细胞增殖作用的影响

不同种浓度的前癃通胶囊都能抑制前列腺基质细胞的增殖，且随着时间的延长抑制作用增强，高浓度组在24、48、72 h 对前列腺基质细胞增殖有明显的抑制作用，与中浓度组比，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；中浓度组在24、48、72 h 对前列腺基质细胞增殖起抑制作用，与低浓度组比，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

表1 不同浓度前癃通胶囊对体外培养基质细胞增殖作用的影响 （±s，n=5）

表1 不同浓度前癃通胶囊对体外培养基质细胞增殖作用的影响 （±s，n=5）

注：与低浓度组比较▲P＜0.01；与中浓度组比较*P＜0.01。

组 别高浓度组中浓度组低浓度组药物剂量（g/mL）0.066 7 0.006 67 0.000 667 24 h 0.397 9±0.019▲*0.116 9±0.013▲0.074 2±0.009 48 h 0.619 2±0.039▲*0.129 3±0.008▲0.090 7±0.025 72 h 0.943 8±0.010▲*0.302 6±0.024▲0.115 8±0.010

2.2 不同浓度组药液对TGF-β1mRNA 表达的影响

前列腺基质细胞中的TGF-β1mRNA 表达随着前癃通胶囊（药液）浓度的增高呈现下降趋势。TGFβ1mRNA 在高浓度组的表达最低，空白组的表达最高。高、中、低浓度组分别与空白组比较差异有统计学意义 （P＜0.01）；高、中浓度组与低浓度组比较TGF-β1mRNA 的表达明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表2。

表2 不同浓度前癃通干预下TGF-β1mRNA表达情况 （±s，n=5）

表2 不同浓度前癃通干预下TGF-β1mRNA表达情况 （±s，n=5）

注：与空白组比较▲P＜0.01；与低浓度组比较*P＜0.01。

组 别高浓度组中浓度组低浓度组空白组药物剂量（g/mL）0.667 0.333 0.167—TGF-β1mRNA 0.3998±0.041▲*0.4785±0.035▲*0.5940±0.050▲0.7289±0.023

3 讨论

TGF-β1 是调节前列腺基质细胞增殖和分化的重要生长因子，是促进BPH 的重要因素[7]。有研究表明，在前列腺组织内TGF-β1 是一种强有力的细胞生长调节物质，由基质细胞分泌，其受体存在于基质细胞和上皮细胞表面，通过自分泌、旁分泌方式抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[8]。TGF-β1mRNA 在增生前列腺组织中呈高水平表达，既可能是TGF-β1 刺激基质细胞增殖导致前列腺增生；也有可能与前列腺组织中存在抗TGF-β1 细胞有关，该细胞的增殖导致了BPH 发生。研究结果提示，不同种浓度的前癃通胶囊都能抑制前列腺基质细胞的增殖，且随着浓度的增加、时间的延长抑制作用增强；前列腺基质细胞中的TGF-β1mRNA 表达随着前癃通胶囊（药液）浓度的增高呈现下降趋势。进一步说明了前癃通胶囊能通过不同程度降低前列腺基质细胞TGF-β1 的表达，从而抑制前列腺基质细胞的增殖，达到治疗前列腺增生的效果。

前癃通胶囊[9-10]是导师贺菊乔教授经过多年的临床经验总结出来的治疗前列腺增生的经验方。由黄芪、田三七、王不留行、丹参、红藤、穿山甲等药组成。其中重用黄芪为君药，益气利水；穿山甲、田三七、丹参、红藤，活血化瘀，软坚散结为臣药；王不留行利尿，活血化瘀为佐药，以辅助君臣药益气利水，活血散瘀。诸药合用，共奏益气利水，活血散结之功。现代药理研究表明：黄芪有增强机体免疫功能，利尿、抗衰老，对包括bcl-2，bux 在内的多种凋亡基因的表达具有调控作用[11]；王不留行可对老年前列腺增生者下丘脑-垂体-性腺轴功能减退有一定改善作用；穿山甲也对包括bcl-2，bux 在内的多种凋亡基因的表达有调控作用。结果提示：前癃通胶囊明显抑制了细胞生长因子TGF-β1 的表达，而且随药物浓度的增加，作用呈增强趋势，说明益气活血化瘀之前癃通胶囊抗BPH 的作用之一是通过抑制TGFβ1 过度表达而抑制增生的前列腺组织新生血管形成。前癃通胶囊治疗BPH 的其作用机制有待进一步研究。

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