何彦峰，杨仁明，胡 娜，索有瑞，王洪伦*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2中国科学院研究生院，北京100049

响应面法优化胡芦巴种子多糖提取工艺

何彦峰1，2，杨仁明1，2，胡 娜1，2，索有瑞1，王洪伦1*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2中国科学院研究生院，北京100049

利用单因素实验及响应面法优化确定胡芦巴种子多糖的提取工艺。通过单因素实验筛选出料液比、提取时间、提取温度三个主要因素，以胡芦巴种子多糖提取得率为响应值进行Box-Behnken中心组合试验设计，建立胡芦巴种子多糖提取得率的二次回归方程，得到优化组合条件。响应面法分析结果表明，当料液比为1∶28 (g:mL)，提取时间1.2 h，提取温度85℃时验证优化工艺得胡芦巴种子多糖最大提取得率19.89%，接近于模型预测值20.24%。

胡芦巴;多糖;响应面法;提取工艺

胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)，又名苦豆、香豆，豆科一年生草本植物，是一种集药用、食用、香料和饲料等价值于一身的经济作物。研究表明其主要含有甾体皂苷类、多糖类、氨基酸、生物碱、黄酮类等化学成分。胡芦巴作为中药具有温肾助阳、催乳、健胃、驱寒止痛等功效［1，2］。近期研究表明，胡芦巴具有降血糖和降血脂功能而被用来治疗糖尿病、心脑血管疾病，并具保肝护肝的功能和抗氧化特性，其主要活性成分为胡芦巴多糖［3-6］。同时，由于胡芦巴多糖具有使食物增稠成型，保持食品色、香、味、结构和食品的相对稳定性等特性而广泛应用于食品工业，并于1999年6月通过全国食品添加剂标准技术委员会第二十次年会的新品种审批，成为一种新的的增稠剂［7］。因此，研究和优化胡芦巴多糖提取工艺对开发和利用胡芦巴资源有重要意义。

本研究在单因素实验的基础上选择料液比、提取时间、提取温度3个主要因素，用苯酚-硫酸法绘制标准曲线，以多糖提取得率为依据，采用响应面法对青海产胡芦巴种子多糖提取工艺进行了优化。以期为研究胡芦巴种子多糖的提取工艺路线提供参考，为胡芦巴资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡芦巴种子2010年8月采自青海省大通县，由中国科学院西北高原生物研究所周昌范高级工程师鉴定;石油醚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、浓硫酸、苯酚和葡萄糖均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DFY1000C高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司;101-1ES电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂;优普UPT系列超纯水器，成都超纯科技有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;UV-759紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;ALC-110.4型电子天平，德国Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作、多糖含量测定［8，9］

精确称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1 g，纯水定容至1000 mL。精密吸取0.1 g/L的葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL试管中，依次加纯水使最终体积为2 mL，然后分别加入5%的苯酚1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，静置10 min，混匀放入30℃水浴加热20 min，取出冷却至室温，用2 mL纯水做空白，于490 nm波长处测样品的吸光度(A)，以多糖浓度(C，g/ mL)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法计算得到回归方程A=0.0102C +0.0815(r=0.9993)。

1.3.2 胡芦巴种子多糖的提取与含量测定

取300 g干燥的胡芦巴种子，用高速万能粉碎机粉碎，过0.25 mm筛，使用石油醚索氏提取3次，每次2 h，挥干石油醚后在干燥箱中30℃烘干，备用。精确称取处理好的胡芦巴种子粉末1.0 g置于250 mL圆底烧瓶中，按照一定的料液比、提取温度、提取时间和提取次数进行加热回流提取，提取完成后3500 rpm离心15 min，上清液用sevage法除蛋白3次，再用3倍体积95%乙醇4℃沉淀24 h，然后将沉淀溶解定容至100 mL容量瓶，按照1.3.1中的步骤测定多糖的吸光度，代入标准曲线方程计算种子多糖含量，并以下式计算提取得率:

多糖提取得率(%)=(胡芦巴种子多糖含量/胡芦巴种子质量)×100%

1.4 实验设计与数据分析方法

1.4.1 单因素实验设计

在进行响应面分析之前，先通过单因素实验选出对胡芦巴种子多糖提取得率具显著影响的因素，并确定其试验水平。参考相关文献，本文称取1.0 g胡芦巴种子，考查了不同的料液比(1∶15～1∶35)、提取温度(50℃ ～90℃)、提取时间(0.5 h～2.5 h)和提取次数(1～4次)对胡芦巴种子多糖提取得率的影响。

1.4.2 响应面法实验设计与数据分析方法

根据Box-Benhnken实验设计原理，选择影响胡芦巴种子多糖提取得率(Y)的3个主要影响因素:料液比(X1)、提取时间(X2)、提取温度(X3)进行组合。以-1、0、1代表自变量水平，xi为自变量的编码值;Xi为自变量的真实值;其关系为xi=(Xi－X0)/ ΔX。其中，X0为试验中心点处自变量的真实值;ΔX为自变量的变化步长［10］。试验因素及水平编码见表1，具体实验设计方案见表2。

表1 Box-Behnken设计因素水平及编码Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

采用Design expert 8.0软件对实验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程。多项式模型方程拟合可靠性由R2表达，R2越接近于1，则多项式模型与实际拟合可靠性越高;其统计学上的显著性由F值检验，F值越大表明该变量对因变量的影响越显著;因素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性由模型系数的P值检验，概率P值越小，则相应变量的显著程度越高，P＜0.01时影响为极显著，P＜0.05影响显著［11］。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对多糖提取得率的影响

设定提取温度为80℃，提取时间为1.5 h条件下，以料液比对多糖提取得率做单因素试验。设计料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。结果表明，多糖提取得率随料液比的增加而呈上升趋势，但料液比在1∶25之后多糖提取得率增长缓慢。从成本和时间方面考虑，料液比选择在1∶25～1∶30之间为宜。

2.1.2 提取温度对多糖提取得率的影响

设定提取时间为1.5 h，料液比为1∶25条件下，以提取温度对多糖提取得率做单因素试验。设计提取温度为50、60、70、80、90℃。结果表明，在小于80℃时，随着温度的升高，多糖提取得率逐渐增加，且增幅明显，80℃时达到最大，之后略显下降。这一趋势可能是由于温度过高，胡芦巴多糖的结构被破坏，使其得率下降。因此选择温度为80℃左右为宜。

2.1.3 提取时间对多糖提取得率的影响

设定提取温度为80℃，料液比为1∶25条件下，以提取时间对多糖提取得率做单因素试验。设计提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h。结果表明，多糖得率随时间的增长呈上升趋势，1.5 h附近达到最大，之后趋于平缓，为减少能耗，节约时间，提取时间选择1.5 h为宜。

2.1.4 提取次数对多糖提取得率的影响

设定提取温度80℃，料液比1∶25(g:mL)，提取时间1.5 h条件下，以提取次数对多糖提取得率做单因素试验。结果表明，提取两次后多糖提取得率基本保持不变，考虑到生产效率，选择提取两次为宜。

2.2 响应面法优化胡芦巴种子多糖提取工艺

2.2.1 响应面分析方案与结果

对胡芦巴种子多糖提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表2。

表2 多糖提取工艺条件的优化试验设计及结果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

表3 方差分析结果Table 3 ANOVA of regression analysis

采用Design-Expert8.0软件对各因素进行回归拟合，得回归方程方程:多糖提取得率=19.47+ 1.43×X1+0.86×X2+1.65×X3-0.87×X1X2-0.84 ×X1X3-0.67×X2X3-1.13×-1.39×-1.64×

由表3可知，方程中除X2X3(时间和温度两因素的交互作用)无显著影响外，三因素的其它交互项、线性及其平方项对多糖提取得率均达到极显著水平(P＜0.01)，三因素与响应值之间线性关系极为显著;R2=0.985表明该二次回归得到的多糖提取得率模型与实际拟合较好，符合度为98.50%，表明使用该方程模拟实际的三因素三水平分析是可行的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对多糖提取得率影响的排序为提取温度(X3)＞料液比(X1)＞提取时间(X2)。

2.2.2 因素间的交互影响

根据拟合模型绘制胡芦巴种子多糖的响应面的三维图与等高线，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最佳工艺参数范围。Design-Expert8.0软件处理后三维响应面和等高线图见图1～3。

图1 Y=f(X1，X2)的响应面与等高线Fig.1 Responsive surfaces and contours of Y=f(X1，X2)

图1为提取温度为80℃时不同提取时间和料液比对胡芦巴种子多糖提取得率的影响，从图中可知，在提取时间较长，料液比较大的范围内可以达到响应值的最高点。

图2为提取时间为1 h时不同提取温度和料液比对胡芦巴种子多糖提取得率的影响。从图中可知，提取温度和料液比较低时，多糖提取得率较低，但提取温度过高，料液比较大时也会导致多糖的提取得率下降，这可能是由于温度过高会破坏多糖结构致使多糖检测量下降。

图3为料液比为1∶25时不同提取时间和提取温度对胡芦巴种子多糖提取得率的影响，从图中可知，在长时高温的提取条件下，样品中的杂质会伴随多糖一起被提出来，从而导致多糖提取得率的下降。

总的来看，提取温度对多糖提取得率的影响最为显著，在所选温度范围内，随着提取温度的不断增高，多糖的提取得率也随之增大，表现为曲面较陡，而提取时间和料液比的影响次之，曲面较平缓。

2.3 胡芦巴种子多糖提取工艺条件的确定

通过软件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最优提取工艺条件为:料液比为1:28.28，提取时间为1.16 h，提取温度为84.85℃，胡芦巴种子多糖的提取得率可达20.24%。考虑到实际操作的可行性，同时又达到节省时间与能耗并取得最佳效果的目的，将胡芦巴种子多糖的提取工艺条件修正为:料液比1∶28，提取时间为1.7 h，提取温度85℃。

按上述最佳工艺即料液比1∶28，提取时间为1.2 h，提取温度85℃提取胡芦巴种子多糖(n=3)以验证响应面法的可行性。结果，平均提取得率为19.89%，与预测值20.24%比较，基本吻合，比单因素平均提取率高4.87%。

3 结论

本文在单因素试验的基础上，采用响应面法对胡芦巴种子多糖提取工艺进行了优化。通过回归方程优化得胡芦巴种子多糖的最佳提取工艺为:料液比1∶28，提取时间为1.2 h，提取温度85℃，此条件下胡芦巴种子多糖平均提取得率为19.89%。回归分析和验证试验结果表明，采用响应面法优化胡芦巴种子多糖的提取工艺条件，得到的多糖提取工艺流程具有实际应用价值。

1 China Pharmacopoeia Committee(国家药典委员会).Ch.P.，Vol.1(中国药典，一部).Beijing:Chemistry Industry Press，2010.225.

2 Jing Y(荆宇)，Zhao YQ(赵余庆).Progress in studies on chemical constituents and pharmacological effect of Trigonella foenum-graecum.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2003，34:1146-1149.

3 Xue WL，Li XS，Zhang J，et al.Effect of Trigonella foenumgraecum(fenugreek)extract on blood glucose，blood lipid and hemorheological properties in streptozotocin-induced diabetic rats.Asia Pac J Clin Nutr，2007，16:422-426.

4 Kaviarasan S.Fenugreek(Trigonella Foenum Graecum)seed extract prevents ethanol-induced toxicity and apoptosis in Chang liver cells.Alcohol and Alcoholism，2006，41:267-273.

5 Zhu BL(朱宝立)，Ban YH(班永红)，Duan JA(段金廒).Protective effect of fenugreek seed on acute chemical liver injury.Chin J Industr Med(中国工业医学杂志)，2000，13: 19-21.

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11 Xu J，Chen W.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surface methodology.Carbohydr Polym，2008，72:67-74.

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.)by Response Surface Methodology

HE Yan-feng1，2，YANG Ren-ming1，2，HU Na1，2，SUO You-rui1，WANG Hong-lun1*
1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing，100049，China

Single-factor tests and response surface method(RSM)were used to optimize the extraction process of fenugreek seed polysaccharides(FSP).In order to obtaining the maximum of extraction yield of the polysaccharides，three main factors including extraction temperature，extraction times and ratio of raw material to water were selected with the Box-Behnken design and a quadric regression equation for predicting the yield of polysaccharides was established.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 85℃，extraction times 1.2 h，and ratio of raw material to water 1∶28.Under the conditions，the optimum extracting yield of FSP was 19.89%，which is well matched with the predictive extracting yield 20.24%.

fenugreek;polysaccharides;response surface methodology;extraction process

1001-6880(2012)10-1463-05

2012-01-04 接受日期:2012-03-29

中国科学院生命科学领域优秀青年科技专项(KSCX2-EW-Q-23)

*通讯作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:hlwang@nwipb.cas.cn

TS255.36

A