张西云，范玉霞，胡国元，李生庆，李秀萍

（青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁810016）

青海省海北州祁连县默勒镇2006～2008年绵羊发生持续死亡，死亡数达6 554只，发病前，该地区每年3～4月用羊三联苗免疫羊群，但仍然有大量羊只发生死亡，经我室确诊为肠毒血症后，采用产气荚膜梭菌标准菌株C60－2（D型），采用优化的培养基配方使该菌的产毒能力提高到3万MLD／mL，制成羊肠毒血症菌苗后2009年、2010年在青海祁连默勒地区免疫绵羊105 000只，结果免疫羊群均未发生本病。为该地区羊肠毒血症的发生和流行提供了有效的菌苗，很大程度上减少了牧民的经济损失。

1 材料

标准的产气荚膜梭菌C60－2菌株（来自中国兽医药品检查所）；VF培养基（本室自制）；健康家兔1.5～2kg购自乐都种兔场；16～20g小鼠购自地方病研究所；甲醛；氢氧化铝胶（本室自制）。

2 方法

2.1 基础液制备 将产气荚膜梭菌标准菌株C60－2（D型）接种到加生肝的V.F培养基中，37℃培养24h，用16～20g小鼠测定毒力。

将培养24h的种子培养物接种至1万mL的大瓶中，37℃培养24h。

2.2 最小致死量测定 吸取大瓶24h培养物1mL，加含2.5g／L胰酶的1%碳酸钠溶液1mL，37℃活化45min，5 000r／min离心15min，上清用生理盐水10倍递减稀释，每一稀释度静脉注射小鼠2只（0.2mL／只）。观察记录结果。

2.3 脱毒 按菌液量的1%加入甲醛后密封，37℃～38℃杀菌脱毒14d，每d充分振荡2次。将脱毒后的样品接种至加生肝的厌气肝汤、普通肉汤、普通斜面上［1］，37℃培养7d观察记录。

2.4 安全检验 将脱毒后的样品经胰酶活化离心，上清静脉注射体重16～20g小鼠2只，每只0.4 mL，观察记录结果。结果：基础液最小致死量为3万MLD／mL；无菌检验，加生肝的厌气肝汤、普通肉汤及普通斜面培养基上均无菌生长；脱毒的样品经胰酶活化离心，上清注射的小鼠健活，脱毒完全。

2.5 制苗 经灭活、脱毒检验合格的基础液，用铜纱滤过，用于配苗。先将检验合格的D型产气荚膜梭菌的脱毒基础液按基础液4份加铝胶1份的比例，加入灭菌的氢氧化铝胶，再按全部容量的0.01%加入硫柳汞充分混合。

制苗完成后，取样做无菌检查，经无菌检验合格后，充分混合，定量分装。

2.6 菌苗检验 本品静置后，上层为黄褐色澄明液体，下层为灰白色的沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

无菌检验：将菌苗接种至生肝的厌气肝汤、普通肉汤、普通斜面培养基，37℃培养7d均无菌生长。

安全检验：用体重1.5～2kg家兔4只，各肌肉注射菌苗5mL，观察14d。未见明显不良反应，注射部位有蚕豆大硬结。

效力检验：取1.5～2kg家兔20只，随机分成4组，免疫组15只，均为皮下注射；对照组5只。饲养至18d，静脉攻毒，观察菌苗保护情况。结果见表1。

表1 菌苗保护情况

2.7 苗的现地使用 2009年6月初在祁连默勒地区用该苗进行小群免疫试验，免疫羊只20只，观察21d，未见不良反应，2009年7月初及2010年7月初在该地区分别免疫羊只6.5万只和4万只，疫苗用时摇匀，不论羊只年龄大小，肌肉或皮下注射2mL。2009年及2010年免疫羊只均未发生羊肠毒血症病。

3 结果与讨论

通过菌苗的安检、效检及现地使用，证明该苗安全有效，是预防绵羊肠毒血症的可靠菌苗。为解决祁连默勒地区使用羊三联苗后仍发生羊肠毒血症的现状提供了保障。