潜阳通络方对肝阳上亢证自发性高血压大鼠左室肥厚及心肌内皮素受体蛋白表达的影响

2012-11-21王洪博徐伟超徐树楠河北省中医院河北石家庄0500

中国老年学杂志 2012年23期

贾蕊王洪博徐伟超徐树楠 (河北省中医院，河北石家庄 0500)

贾蕊王洪博1徐伟超徐树楠2(河北省中医院，河北石家庄 050011)

目的观察潜阳通络方对肝阳上亢证自发性高血压大鼠(SHR)左室肥厚(LVH)及心肌ET受体(ETa、ETb)蛋白表达的影响。方法

用32只14周龄SHR大鼠，随机分为模型组(M)、潜阳通络方低剂量组(L)、潜阳通络方高剂量组(H)和卡托普利对照组(C)。另购8只14周龄雄性Wistar大鼠，为空白对照组(K)。参照相关文献，将SHR大鼠加灌附子汤法造肝阳上亢模型，实验期间每周末测量血压，实验结束后取材，测量左室重量指数(LVMI)及ET受体蛋白表达。结果 ①对血压的影响：治疗结束后，与M组相比，其余各治疗组血压均有显著下降(P＜0.01)，其中C、L、M三组之间两两比较，也均有显著差异(P＜0.01);②对LVMI影响：与M组比较，D及G组LVMI均显著降低(P＜0.05)，C组与M组比较，无显著变化(P＞0.05);③对ET受体(ETa、ETb)蛋白表达的影响：M组大鼠ETa表达较K组明显升高(P＜0.05)。治疗后，与M组比较，C组、L组、H组明显降低(P＜0.05)，且L、H两组效果优于C组(P＜0.05);M组大鼠ETb表达较N组明显升高(P＜0.05)。治疗后，与M组比较，C组、L组、H组明显降低(P＜0.05)，且H组效果优于C、L两组(P＜0.05)。结论潜阳通络方的降压和逆转左室肥厚机制初步认为与其降低体内ET受体(ETa、ETb)表达有关。

血压;左室重量指数;ET受体表达

中医对高血压病左室肥厚的认识，以往多单纯责于肝阳、肝风、气滞(虚)血瘀、痰浊等为其病机基础，论治上则对应地用潜阳、息风、行(补)气活血、化痰为常规法则，但临床疗效尚难尽如人意。究其原因在于本病的病因虽不一，但患者多为中老年人，均有脏腑阴阳气血趋衰的共同表现，发展到一定程度，其基本发病机理大都是由阴阳失调，肝肾亏虚，肝阳偏旺，阳亢血涩，心脉瘀阻，心体负重所为。因此，我们对该病的病机提出“阳亢络阻，心脉壅滞”学说，并拟定了潜阳通络方治疗高血压左室肥厚，验之临床取得了较好的疗效。为了进一步阐明本方的治疗作用机制，采用病证合一的实验方法，以自发性高血压大鼠(SHR)左室肥厚加灌附子汤法复制肝阳上亢证模型后，再用潜阳通络方进行动物实验，观察该方对血压、左室重量指数(LVMI)及内皮素(ET)受体(ETa、ETb)蛋白表达的影响，目的为应用本方治疗高血压左室肥厚提供理论依据和实验数据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

潜阳通络方由龟板20 g(先煎)，牡蛎30 g(先煎)，怀牛膝 30 g，白芍20 g，天麻12 g，石决明30 g(先煎)，钩藤 12 g(后下)，赤芍15 g，丹参20 g，全蝎6 g，地龙12 g，当归12 g，甘松9 g等药组成(购自石家庄市乐仁堂大药房)。卡托普利(规格25 mg，常州制药厂生产，批号09120212)。免疫组化及DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 动物

14周龄SHR32只，雄性，体重280～320 g，血压160～190 mmHg，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号0166397)。14周龄 Wistar大鼠8只，雄性，体重280～320 g，购自河北医科大学实验动物中心(合格证号1003163)。

1.3 仪器与设备

BESN-Ⅱ 型多通道动物无创测压系统，南京德赛生物技术有限公司生产;HMIAS-2000显微图像分析系统，购自武汉同济医科大学;自制旋转平台。

1.4 实验方法

1.4.1 给药方法 32只SHR随机分为模型组(M)、潜阳通络方低剂量组(L)、潜阳通络方高剂量组(H)、和卡托普利对照组(C)。8只Wistar大鼠空白对照组(K)。以上各组均适应性饲养1 w，开始进入实验观察。大鼠模型参照相关文献〔1〕，选用SHR加灌附子汤的方法造模，灌胃剂量为10 ml·kg-1·d-1，相当生药剂量2 g·kg-1·d-1，共4 w，同时观察大鼠基本情况变化：当出现毛色干枯、失去光泽、消瘦、饮水量增多、性情暴躁、旋转时间缩短等异常表现则提示造模成功。随即停止灌服附子汤，空白组和模型组改灌等量蒸馏水，卡托普利组灌服卡托普利混悬液，生药剂量8 mg·kg-1·d-1，潜阳通络方低剂量组灌服中药浓缩液，生药剂量24.6 g·kg-1·d-1，潜阳通络方高剂量组生药剂量49.2 g·kg-1·d-1，以上各组均由凉白开水和普通饲料饲养，共6 w。

1.4.2 指标检测 ①血压测定：造模结束后，分别于每周末测量血压，按照无创测压仪说明书规范操作，每只大鼠测三次取平均值，作为其在该周的血压值;②LVMI：大鼠断头处死后，迅速打开胸腔，取出心脏，蒸馏水冲洗，洗净血液，滤纸吸干，沿房室间沟剪去心房，再沿室间隔剪去右心室，剩下左心室，称重后计算心肌重量与体重之比，即为左室重量指数;③大鼠ET受体蛋白表达的检测：采用免疫组化染色法。取左心室小块心肌，石蜡包埋切片，常规脱蜡至水。热修复抗原，3%H2O2去离子水孵育5～10 min，消除内源性过氧化物酶活性。滴加正常山羊血清工作液封闭特异性抗原。滴加一抗，37℃孵育2～3 min，4℃过夜。PBS冲洗3次。滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育10～15 min。再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10～15 min。DAB显色，复染、脱水、透明，中性树胶封片，HMIAS-2000显微图像分析系统拍照。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 潜阳通络方对SHR血压的影响

表1显示，与K组相比，M组血压明显上升(P＜0.01);治疗结束后，与M组相比，其余各治疗组血压均有显著下降(P＜0.01)，其中C、L、M三组之间两两比较，也均有显著性差异(P＜0.01)，但C与K比较差别不显著(P＜0.05)。

表1 潜阳通络方对SHR血压的影响(±s，n=8，mmHg)

与K组比较：1)P＜0.01;与M比较：2)P＜0.01;与C组比较：3)P＜0.01;与L组比较：4)P＜0.01

组别治疗后1 w 治疗后2 w 治疗后3 w 治疗后4 w 治疗后5 w 治疗后6 w K组 108.50±0.87 109.63±1.51 108.00±1.31 107.88±0.83 109.13±0.54 109.13±0.79 M组 201.63±0.921) 201.38±0.781) 201.38±0.631) 208.00±0.931) 209.25±0.591) 208.75±0.561)C组 144.13±0.932) 111.75±1.732) 109.50±1.21 11.00±0.962) 111.00±0.962) 112.25±0.922)L组 191.13±1.102)3) 178.00±1.162)3) 167.50±1.242)3) 160.00±0.802)3) 152.88±1.012)3) 153.63±1.032)3)H组 190.75±0.982)3) 180.50±1.022)3) 169.25±1.362)3) 160.75±0.992)3) 150.88±0.772)3) 147.75±1.062)3)4)

2.2 潜阳通络方对SHR LVMI的影响

与K组相比，M组LVMI明显升高〔(2.63±0.04)mg/kg vs(1.91±0.07)mg/kg，P＜0.01〕;与 M组相比，L、H剂量中药治疗组 LVMI明显下降〔(2.48±0.04)mg/kg，P＜0.05〕;C组与 M 组相比差别不明显〔(2.57±0.02)mg/kg，P ＞0.05〕，H 组与 C 组相比差别明显(P＜0.05)。

2.3 潜阳通络方对SHR ET受体蛋白表达的影响

表2显示：M组大鼠ETa受体表达较K组明显升高(P＜0.05)。治疗后，与M组比较，C组、L组、H组明显降低(P＜0.05)，且L、H两组效果优于C组(P＜0.05)。M组大鼠ETb受体表达较K组明显升高(P＜0.05)。治疗后，与M组比较，C组、L组、H组明显降低(P＜0.05)，且H组效果优于C、L两组(P＜0.05)。图1、图2显示黄色区域较多则表达较明显，N组大鼠ET受体表达正常，黄色区域不明显。M组大鼠ETRa、ETRb受体表达明显增强，黄色区域分布广、密度高。经治疗后L组、H组表达均不同程度下降，黄色区域分布密度较稀疏，X组变化不明显。

表2 潜阳通络方对SHR ET受体蛋白表达的影响( s，n=8)

与K组比较：1)P＜0.05，与M组比较：P＜0.05，与C组比较：3)P＜0.05，与 H组比较：4)P ＜0.05

组别ETa ETb K组0.183±0.004 0.182±0.002 M组 0.295±0.0041) 0.291±0.0031)C组 0.276±0.0041)2) 0.266±0.0021)2)3)L组 0.248±0.0041)2)4) 0.262±0.0021)2)4)H组 0.243±0.0041)2)3) 0.244±0.0031)2)

图1 潜阳通络方对SHR ETa受体蛋白表达的影响(×200)

图2 潜阳通络方对SHR ETb受体蛋白表达的影响(×200)

3 讨论

我们认为，高血压左室肥厚的病位在心络，涉及肝肾，主要病机为“阳亢络阻，心脉壅滞”，是在肝肾阴虚的基础上衍生的。产生的原因有二：一是肝热致络阻。高血压患者素来性情急躁，日久肝郁化热，血受热煎熬凝聚，而成热瘀互结，血脉郁滞而导致瘀血阻络。此即是《医林改错》所说的“血受热则煎熬成块”之理。二是阴亏致络阻。高血压阳亢证是在阴亏的基础上产生的，阴虚则津亏液少，势必不能载血循经畅行，加之阳亢燥热内灼，煎熬营血，血行涩滞，可导致瘀血阻络，故《读医随笔》说：“阴虚必血滞。”由此可见，不论是肝热致络阻，还是阴亏致络阻，皆导致血行涩滞，心亦受累，势必加重心主血脉的负荷而病为心脉痹阻，日久则心体增生变厚，临床即出现所谓左室肥厚的病理改变。鉴于此，潜阳通络方中重用怀牛膝活血化瘀、引血下行，以减轻头部充血，且能补肝肾以治其本，有移盈补亏之效;龟板、白芍、天麻益阴潜阳;石决明、牡蛎、钩藤清肝、平肝潜阳，以降肝火夹血上冲;全蝎、地龙通经活络;赤芍、丹参活血化瘀，以增强通经药通行络脉之力;当归补血活血，通过补虚行瘀之途径来改善血流供求平衡;甘松行气，以增强活血通络之力。诸药合用，共成滋阴潜阳，通络活血之剂。

现代药理学研究认为：钩藤、地龙、全蝎能直接和间接抑制血管运动中枢及阻滞交感神经和神经节，扩张血管，使外周血管阻力降低;怀牛膝、赤芍、石决明能扩张血管，降低外周血管阻力;白芍不仅抑制血管紧张素Ⅱ形成而产生降压作用，而且又能够逆转左室肥厚;当归、丹参、赤芍除扩张血管作用外，又有钙离子拮抗作用，在降低血压、逆转左心室肥厚的同时，可使细胞膜钠泵活性及线粒体钙泵运动恢复;龟板有补血，镇静及抗凝血，增加冠脉血流量等作用;牡蛎有镇静，抗凝血，抗血栓作用;天麻能对抗肾上腺素的缩血管效应，舒张周围血管，降低血管阻力，从而达到降压之效，且天麻有止痛作用，可对高血压引起的头痛有很好的治疗效果;甘松有降血压，抗心肌缺血，抗心律失常等作用。基于这些药理作用，所以用滋阴潜阳、通络活血药组成复方，共同达到扩张血管，降低血压，改善血液循环，减轻或逆转左室肥厚的目的。

ETa亚型受体分布血管平滑肌上，激动时引起血管收缩;ETb亚型受体分布于血管内皮细胞上，激动时通过释放EDRF(内皮依赖性舒张因子)引起血管舒张〔2〕。而ET与血管平滑肌细胞上的ETa受体结合，既可直接刺激血管平滑肌细胞增殖肥大，使血管变窄、管壁增厚，增加外周阻力使心脏后负荷增加;同时又能刺激其他血管物质，如去甲肾上腺素(NE)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的释放，引起缩血管作用，产生高血压(EH)和促心肌平滑肌细胞增殖，如此形成恶性循环〔3〕。若ET与血管内皮细胞上的ETb受体结合，则刺激内皮细胞释放舒血管因子，可起到扩张血管，增加一氧化氮和前列环素浓度，增加肺清除ETa等作用〔4〕。缘于此，ETa和ETb则构成了一对具有拮抗效应的血管活性物质。由于血管内皮细胞既可合成和释放ET，也可释放内皮依赖性舒张因素(EDRF)和前列环素(PGI2)，后两者均可拮抗ETa的缩血管效应，扩张血管平滑肌，此为调节血管基础张力，维持血压稳定的主要因素。因此，血管对ETa的缩血管反应取决于血管内皮细胞释放的舒血管因子与缩血管因子之间的动态平衡，舒张因子占优势，可以抑制血管过度收缩及血小板的激活，从而对循环系统起到了保护作用〔5〕。但衰老或疾病时(如高血压、高脂血症及动脉粥样硬化)，这些保护机制失去平衡，则收缩因子占优势，从而内皮依赖性舒张减弱，而ETb不能拮抗ETa，就导致血管收缩，外周血管阻力增加，产生高血压及心肌平滑肌细胞增殖。可见，ETa和ETb比例失衡在高血压左心室肥厚发生、发展过程中起着重要的作用。

本实验结果提示潜阳通络方能够降低内皮素受体在心脏局部的表达，是通过调节ETa和ETb受体的表达比例，使二者失衡状态得以纠正，血管舒缩功能得到改善，进而降低血管的阻力、阻止心脏及血管增生，从而达到降低血压和逆转心肌细胞增生肥大的作用。但具体作用机制有待进一步研究。

1 鄢东红，金益强，肖纯.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制〔J〕. 湖南中医学院学报，1999;19(4)：35-8.

2 卫生部继续教育委员会.心血管病学分册〔M〕.长春：长春出版社，1999：305.

3 叶平，李小鹰.高血压的诊断与治疗〔M〕.北京：人民军医出版社，2000：74.

4 孔令雷，颜玲娣，宫泽辉.内皮素系统与心肌肥厚〔J〕.中国药理学通报，2008;24(9)：1127-30.

5 Furchgott RF，Yanhoutte PM.Endothelium dependent relaxing and contracting factors〔J〕.FASEB J，1989;3(9)：2007-18.

R541.4

1005-9202(2012)23-5212-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.050

河北省中医药管理局项目(No.2007017)

1 河北省胸科医院 2 河北医科大学中医学院

徐树楠(1952-)，男，硕士生导师，主要从事中药基础理论及其对心血管病应用的研究。