艾旭 李昀 邓冲 胡方靖 武军驻

白藜芦醇对肝癌Bel-7404细胞增殖、凋亡、侵袭影响机制研究

艾旭①②李昀①②邓冲①②胡方靖①②武军驻①

目的：观察白藜芦醇对肝癌Bel-7404细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，并研究其内在分子机制。方法：采用MTT法检测白藜芦醇对Bel-7404细胞增殖的影响；流式细胞术检测白藜芦醇对Bel-7404细胞凋亡的影响；Transwell法检测白藜芦醇对Bel-7404细胞侵袭的影响。结果：白藜芦醇可以抑制Bel-7404细胞增殖，也可以诱导Bel-7404细胞凋亡，均呈浓度依赖性，与下调Procaspase3和PARP蛋白表达有关。白藜芦醇可以抑制Bel-7404细胞侵袭性，呈浓度依赖性，与下调MMP-9、VEGF蛋白表达有关。结论：白藜芦醇可以抑制肝癌Bel-7404细胞增殖，通过剪切Procaspase3、PARP蛋白而诱导凋亡，通过下调MMP-9和VEGF蛋白表达水平而抑制Bel-7404细胞侵袭性。

白藜芦醇； 肝癌Bel-7404细胞； 增殖； 凋亡； 侵袭； 影响

白藜芦醇(resveratrol，Res)是从葡萄、虎杖等植物内提取的一种多酚类化合物，其在抗炎、抗氧化、调节脂质代谢和改善微循环等方面都有一定的生物活性。而近年来多项研究显示，白藜芦醇在抗肿瘤治疗和化学预防方面都显示出一定的效果[1-3]。目前其在原发性肝癌的治疗方面有一些研究，但其内在的抗肿瘤机制尚不明确[4-5]。本研究旨在观察白藜芦醇对肝癌Bel-7404细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，并探讨其内在分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌Bel-7404细胞(中科院上海细胞库)；白藜芦醇、噻唑蓝(MTT)(美国sigma公司)；新生牛血清、RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；纤连蛋白(FN)和基底膜基质凝胶Matrigel(美国BD公司)；羊抗鼠Procaspase3，PARP，VEGF，MMP-9(美国Santa cruze公司)。

1.2 细胞培养 肝癌Bel-7404细胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱内培养， 取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT增殖检测 将细胞用0.25%的胰酶消化，计数，制成2×105/ml的单细胞悬液，按照每孔100 μl接种与96孔板中，白藜芦醇的最终浓度分别为25，50，100，200 μmol/L，分别在12、24、48 h孵育后换用不含血清的培养基每孔100 μl，避光条件下每孔加入MTT液10 μl(5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃去上清液，各孔加入DMSO100 μl，摇床震荡10 min，酶标仪(Bio-Rad550型，美国Bio-Rad公司)检测560 nm的OD值，取3孔平均值。实验重复三次。抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡检测 白藜芦醇的最终浓度分别为0、25、 50、100 μmol/L孵育细胞48 h后，0.25%胰酶消化，1000 r/min离心，弃去上清液，用PBS洗一遍，离心得到细胞团。将细胞重悬于200 μl Binding Buffer，加入5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl PI，4 ℃避光30 min，然后立即上流式机检测(COULTER EPICS XL型，美国Beckman Coulter 公司)。

1.5 Transwell侵袭检测 在Transwell小室滤膜的下室面铺上FN并风干后，在小室上表面均匀铺上1:3 RPMI1640稀释的Matrigel，置于37 ℃培养箱30 min使之凝固。取1×106/ml Bel-7404细胞 悬液(培养基为0.1% BSA的RPMI 1640)，加药组Transwell小室的上室内加入白藜芦醇(终浓度25 μmol，50 μmol/L)，下室内分别加入用上述培养基制成白藜芦醇溶液600 μl，终浓度与上室内相同，各组设3复孔。培养箱内培养12 h后取出滤膜，用甲醇固定，用棉签擦去上内面内细胞，用结晶紫染色，随机于显微镜下取5个视野，计数穿膜细胞数。以计数穿膜细胞数目来间接反映肿瘤细胞侵袭能力大小。

1.6 蛋白印迹实验 收集各组处理细胞，每5×106细胞加入200 μl细胞裂解液，吹打并剧烈震荡30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清液于100 ℃、5 min变性，测蛋白浓度分装备用，每孔上样40 μg后电泳，恒流300 mA转膜75 min，转移后的PVDF膜经5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后与1:1000鼠抗人MMP-9、Pro-caspase3、PARP-1、VEGF抗体4 ℃孵育过夜，而后加1:1000羊抗鼠抗体，室温反应90 min，化学发光法检测，暗室内压片曝光，显影后胶片用Genetools软件分析灰度值。各目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值即为蛋白相对表达量。实验重复三次。

1.7 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计分析，两样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对Bel-7404细胞增殖影响 白藜芦醇可以明显抑制Bel-7404细胞增值，呈浓度依赖性和时间依赖性。见图1。

图1 RES抑制Bel-7404细胞增殖

2.2 白藜芦醇对Bel-7404细胞凋亡的影响 白藜芦醇在孵育细胞48 h后可以诱导Bel-7404细胞凋亡，呈浓度依赖性。50 μmol/L和100 μmol/L 的浓度可以明显诱导细胞凋亡(P<0.001)。见图2。此外白藜芦醇可以诱导Caspase-3酶原的激活，并剪切凋亡底物PARP-1，引起了凋亡的产生。

图2 RES诱导Bel-7404细胞凋亡

2.3 白藜芦醇对Bel-7404细胞侵袭能力的影响 白藜芦醇可以在25 μmol/L 和50 μmol/L均可以明显抑制细胞的侵袭能力，见图3。并且MMP9和VEGF的蛋白水平表达也呈浓度梯度下降。

图3 RES抑制Bel-7404细胞侵袭能力

3 讨论

多项研究显示，RES在致癌的三个主要阶段均有化学预防、抗起始活性、抗促进和抗发展作用。最重要的是RES具有广泛的抗肿瘤作用和化疗、放疗增敏作用。RES可以通过诱导多种凋亡通路的激活来实现抗肿瘤作用，笔者研究发现，RES可以诱导Bel-7404细胞凋亡，呈浓度依赖性，并伴随着Procaspase3和PARP-1蛋白的激活、剪切。程海燕等[6]研究发现，RES可以通过激活Caspase3通路来诱导胰腺癌细胞的凋亡产生，这与笔者的研究结果一致。因此，笔者考虑RES是通过诱导Caspase3酶原激活、剪切，并引起凋亡的作用底物PARP-1的剪切而引起细胞凋亡发生的。Kuo等[7]研究指出，RES还可以通过P53依赖途径在Hep G2细胞内诱发凋亡。至于P53途径是否是RES在Bel-7404细胞诱导凋亡的依赖通路还有待进一步研究。

肝癌的复发、转移与患者预后密切相关，而肿瘤血管生成又是促进癌症复发、转移必不可少的重要生物学过程之一。而VEGF是肿瘤新生血管形成的必要元素，它的表达可以作为评价肿瘤血管生成的一项指标。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员，主要功能是降解细胞外基质，是肿瘤细胞侵袭和细胞外基质重塑、肿瘤血管基底膜重塑的重要分子基础，与肿瘤细胞的侵袭力密切相关，可以作为评价肿瘤细胞侵袭能力强弱的一项指标。赵占考等[8]研究发现，肿瘤血管MVD增高、MMP-2、MMP-9过度表达可能与肝细胞肝癌转移、不良生存预后存在相关性。笔者的研究结果显示，RES可以明显降低Bel-7404细胞的侵袭能力，并伴随VEGF和MMP-9蛋白的下调。Yu等[4]研究发现RES可以通过NF-kB信号通路减少Hep G2肝癌细胞VEGF的表达，从而有效地抑制裸鼠移植瘤的生长和血管生成。

目前抗肿瘤治疗趋向于靶向治疗和多药联合治疗，因此，研究RES特定的分子机制将给未来肝癌的抗肿瘤治疗提供精确地靶点，为联合化疗提供理论依据。

[1] Boddicker R L，Whitley E M，Davis J E，et al.Low-dose dietary resveratrol has differential effects on colorectal tumorigenesis in adiponectin knockout and wild-type mice[J].Nutr Cancer，2011，63(8):1328-1338.

[2] Huang X，Zhu H L.Resveratrol and its analogues:promising antitumor agents [J].Anticancer Agents Med Chem，2011，11(5):479-490.

[3] 张瑶，张淑兰.白藜芦醇对宫颈癌HeLa细胞表皮生长因子表达的影响[J].中国肿瘤临床，2008，35(15):884-886.

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[5] 汪维佳，虞娉.白藜芦醇增强顺铂对肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用[J].实用肿瘤杂志，2009，24(2):157-159.

[6] 程海燕，周家华，杨德同.白藜芦醇诱导胰腺癌细胞凋亡通路的实验研究[J].现代医学，2010，38(5):515-517.

[7] Kuo P L，Chiang L C，Lin C C.Resveratrol-induced apoptosis is mediated by p53-dependent pathway in Hep G2 cells[J].Life Sci，2002，72(1):23-34.

[8] 赵占考，孙保存，孙涛，等.肝细胞肝癌中微血管密度及MMP-2和MMP-9的表达与术后转移及预后的关系[J].中国肿瘤临床，2010，37(7):385-387.

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.006

①武汉大学基础医学院 湖北 武汉 430060

②湖北省荆门市第一人民医院

艾旭

2012-04-10) (本文编辑：连胜利)