郭 佳， 边云飞， 王 丽， 杨慧宇， 肖传实

(1山西医科大学，2山西医科大学第二医院心内科，3山西医科大学第一医院，山西 太原 030001)

1000-4718(2012)05-0858-07

2011-03-12

2012-03-16

△ 通讯作者 Tel：0351-3362132;E-mail： ganxibaozhongxin@sina.com

胰高血糖素样肽-1对大鼠心肌缺血再灌注/细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制

郭 佳1， 边云飞2， 王 丽2， 杨慧宇2， 肖传实3△

(1山西医科大学，2山西医科大学第二医院心内科，3山西医科大学第一医院，山西 太原 030001)

目的观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对大鼠心肌缺血再灌注/细胞缺氧复氧损伤的作用并探讨其机制。方法建立大鼠缺血再灌注模型，分别设假手术组(sham)、缺血再灌注组(IR)和IR + GLP-1(0.030 nmol/L、0.16 nmol/L和0.30 nmol/L)组，缺血30 min后再灌注3 h，Evan’s blue-TTC法检测心肌梗死范围；取左心室游离壁心肌组织，TUNEL法检测心肌细胞凋亡，同时测定心肌组织中氧化-抗氧化物质超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；培养乳鼠心肌细胞，随机分为正常对照组(control)、单纯缺氧复氧组(HR)、HR + GLP-1(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)组，电镜下观察心肌细胞形态的变化，流式细胞术检测心肌细胞的凋亡，测定乳酸脱氢酶(LDH)释放、SOD活性、MDA含量、活性氧簇(ROS)水平以及线粒体膜电位(MMP)。结果与IR组相比，IR+GLP-1(0.03 nmol/L、0.16 nmol/L和0.30 nmol/L)组剂量依赖性地减小心肌梗死面积，减轻线粒体超微结构改变及细胞凋亡，增加SOD活性，减少MDA含量(P<0.05 或P<0.01)；与HR组相比，HR+GLP-1(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)组剂量依赖性地逆转HR诱导的细胞损伤，增加SOD活性，减少MDA含量，降低ROS水平，减轻HR诱导的MMP降低(P<0.05或P<0.01)。结论GLP-1可以减轻大鼠心肌缺血再灌注/细胞缺氧复氧损伤；其作用机制可能与增强心肌抗氧化能力及保护线粒体结构和功能有关。

胰高血糖素样肽-1； 缺血再灌注损伤； 缺氧复氧； 心肌细胞； 抗氧化； 线粒体膜电位

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)又称为肠促胰岛素、类胰升血糖素-1或胰升血糖素样肽-1。人们对GLP-1的研究多集中于它在糖尿病的发生、发展以及治疗领域的作用上，新近国外研究提出GLP-1对心肌损伤具有一定的保护作用。Nikolaidis等[1]研究发现给予扩张性心肌病狗GLP-1后，心肌细胞对葡萄糖的摄取和左心室的收缩功能均有明显的改善。此外对心肌梗死病人给予GLP-1也可以改善患者的心功能以及血管成形术后严重的左心室收缩功能不良[2]。心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)是临床上最为常见的损伤心肌的病理生理过程之一[3-4]。但是目前国内关于GLP-1对心肌缺血再灌注损伤作用的研究还相对较少，其相关机制仍尚未阐明。

本实验以在体大鼠和体外培养乳鼠心肌细胞为模型，观察GPL-1对心肌细胞损伤的影响，并初步探讨其作用机制，为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的线索和思路。

材 料 和 方 法

1主要仪器和试剂

健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠及 1～3日龄SD 乳鼠均由山西医科大学实验动物中心提供。胰高血糖素样肽-1(Sigma)；兔抗鼠α-肌动蛋白Ⅰ抗(北京博奥森)；RBITC-羊抗兔Ⅱ抗(solarbio，Spain)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染色试剂盒(晶美生物工程有限公司)；细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche)；二氯荧光素二乙酯(DCF-DA，Sigma)；线粒体膜电位检测试剂(JC-1，凯基生物科技发展有限公司)。倒置显微镜(Nikon TS100)；动物人工呼吸机(成都泰盟科技有限公司，HX-100E)；多道生理信号采集处理系统(RM6240BD，成都仪器厂)；激光扫描共焦显微镜(Olympus FV1000)；透射电镜(JEM-CX100)。

2缺血再灌注模型建立

戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定。记录Ⅱ导联心电图，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，经胸骨左缘第2～3肋间打开胸腔暴露心脏，于左心耳根部下方2 mm处用5 /0线结扎冠状动脉前降支，将丝线两端穿过1根聚乙烯小管，止血钳夹持细管，结扎线以下心肌组织颜色变暗，在Ⅱ导联心电图见R波明显增大伴ST 段即刻抬高，说明心肌已缺血。30 min后予以再灌注，以缺血区转红，相关导联ST段明显回落为再通标志，并持续3 h。

3乳鼠心肌细胞的培养

取1～3 d龄SD大鼠，雌雄不限，开胸取心室肌作原代细胞培养，差速贴壁法分离纯化心肌细胞，48 h后更换培养基。培养3～4 d后，倒置显微镜下观察细胞自发搏动情况。针对胞浆中α-actin，采用抗α-actinⅠ抗与FITC标记的荧光Ⅱ抗，免疫荧光法鉴定心肌细胞。

4心肌细胞缺氧/复氧模型的建立

采用Koyama等[5]的方法，配制缺氧液和复氧液。缺氧液(NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO36.0 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，乳酸钠40 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，pH 6.8，37 ℃),预先用高浓度氮气饱和(>99.9%，1 L/min×30 min)，测血气PO2≤4.0 kPa；复氧液(NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO320 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，NaCl 129.5 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，pH 7.4，37 ℃)，预先用纯氧饱和(1 L/ min×30 min)。实验时弃去原培养液，用缺氧液漂洗细胞2次，换预先经高浓度N2饱和的缺氧液，培养板置纯N2持续通气的密闭容器中(37 ℃)3 h，再换预先经纯氧饱和的复氧液，以纯O2复氧孵育1 h(37 ℃)。

5实验分组

实验动物随机分为5组，每组16只。假手术组:穿线但不行冠脉结扎；IR组：开胸结扎冠状动脉左前降支30 min，松解结扎后再灌注3 h；IR+GLP-1组：于缺血再灌注前30 min经舌静脉缓慢注入GLP-1(0.03 nmol/L、0.16 nmol/L和0.30 nmol/L)，随后处理同IR。

乳鼠心肌细胞培养3 d后，给予缺氧复氧处理，实验分为5组：正常对照组； HR组；HR + GLP-1(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)组：GLP-1预孵育24 h后给予缺氧复氧处理。

6心肌梗死面积的测定

大鼠经再灌注3 h后再次原位结扎左冠状动脉，经颈动脉注入伊文氏蓝。取出心脏，切片，TTC染色，蓝色为未缺血区域、红色为缺血区域。将红色的缺血心肌片置于TTC磷酸缓冲液染色。缺血但未梗死心肌染成红色，梗死心肌则为灰白色，称量缺血未梗死心肌和梗死心肌湿重。心肌缺血范围=缺血心肌面积/左心室面积(area at risk/left ventricular area，AAR/LV)；心肌梗死范围=坏死区面积/危险区面积(necrotic area/area at risk,NEC/AAR)。

7心肌超微结构观察

迅速取下心尖部心肌组织切成1 mm×1 mm×1 mm，戊二醛磷酸盐缓冲液、锇酸各固定2 h，脱水、包埋、切片、醋酸双氧铀、枸橼酸双重染色，透射电镜下观察心肌细胞超微结构。

8心肌细胞凋亡测定

采用TUNEL凋亡试剂盒检测各组心肌组织中的凋亡细胞，激光扫描共焦显微镜下观察，TUNEL阳性细胞核呈绿色荧光。

9流式细胞仪检测心室肌细胞的凋亡率

0.125%胰蛋白酶制备单细胞悬液，用Annexin V-FITC/PI双染色标记法进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。

10心肌氧化、抗氧化物质检测

再灌注3 h结束后取左心室前壁心肌组织，-70 ℃冰箱冻存，制备组织匀浆，按试剂盒说明书操作检测SOD活性和MDA含量。复氧1 h后收集各组心室肌细胞培养液，按照乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、 MDA、SOD试剂盒的操作说明测定各实验组心肌细胞培养液中LDH、MDA的含量及SOD活性。

11细胞内ROS含量检测

心肌细胞内ROS产生水平通过使用ROS敏感的荧光探针DCF-DA测定。细胞爬片，给予相应处理后，DCF-DA染液37 ℃孵育30 min。荧光显微镜下随机采集5个不重复区。用ImageJ软件进行荧光强度分析。

12线粒体膜电位检测

收集细胞，加入JC-1溶液(10 mg/L)，37 ℃、5%CO2培养箱孵育15 min，清洗，重悬细胞，在荧光显微镜下观察，正常细胞线粒体发射红色荧光，同一滤光镜下呈橙色，细胞凋亡时红色荧光强度减弱，绿色荧光增强，同一滤光镜下呈绿色。图像结果用ImageJ软件分析计算绿色和红色荧光强度平均值，绿色与红色荧光强度的比值代表心肌细胞去极化程度。

13统计学处理

结 果

1心肌梗死面积

假手术组心肌缺血范围为0，IR组与GLP-1+ IR组AAR/LV差异无显著(P>0.05)，说明实验操作手法基本一致，排除了由此而造成的误差。与IR组比较， IR+GLP-1组NEC/AAR明显下降(P<0.05)，见表1。

表1心肌梗死面积

GroupAAR/LVNEC/AARSham00IR0.65±0.060.44±0.07IR+GLP-1(0.03nmol/L)0.62±0.090.40±0.08*IR+GLP-1(0.16nmol/L)0.63±0.060.39±0.08*IR+GLP-1(0.30nmol/L)0.63±0.070.36±0.09*

*P<0.05vsIR group.

2心肌细胞超微结构观察

假手术组线粒体沿肌丝长轴排列整齐，外膜完整, 嵴密集, 基质致密, 内有电子致密颗粒。胞核呈椭园形, 异染色质分布均匀。IR组出现广泛的线粒体损伤，表现为线粒体肿胀，基质明显变淡,嵴排列紊乱。核皱缩，染色质凝集。GLP-1预处理组除部分区域线粒体有改变外, 与对照无明显区别，见图1。

Figure 1. The ultrastructural changes of the myocardial tissues in different groups(×12 000).A: sham group; B: IR group; C: IR + GLP-1(0.03 nmol/L); D: IR+GLP-1 (0.16 nmol/L); E: IR+GLP-1 (0.30 nmol/L).

图1心肌组织电镜下形态

3各组心肌组织中的细胞凋亡情况

TUNEL染色结果显示：与sham 组相比，IR 组心肌组织可见大量凋亡细胞，IR+GLP-1(0.03 nmol/L、0.16 nmol/L和0.30 nmol/L)组凋亡细胞较 IR 组明显减少,见图2。

图2TUNEL法检测各组心肌组织中细胞凋亡情况

4心肌氧化、抗氧化物质检测

与IR组相比，IR+GLP-1(0.03 nmol/L、0.16 nmol/L和0.30 nmol/L)组再灌注末心肌组织中抗氧化酶SOD含量明显高于IR组，而MDA含量则明显降低(P<0.05)，见表2。

表2GLP-1对心肌氧化-抗氧化系统的作用

GroupSOD(103U/gprotein)MDA(μmol/gprotein)Sham62.20±4.582.63±0.22IR46.31±3.56*5.45±0.46*IR+GLP-1(0.03nmol/L)50.64±5.26*#5.02±0.61*#IR+GLP-1(0.16nmol/L)57.04±6.38*#4.89±0.57*#IR+GLP-1(0.3nmol/L)59.72±5.81*#4.24±0.58*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

5乳鼠心室肌细胞的培养与鉴定

倒置相差显微镜下可见原代乳鼠心肌细胞成簇生长，伸出伪足，折光性强，且搏动明显，见图3A。免疫荧光法鉴定：荧光倒置显微镜下可见细胞呈扁平多角形，胞浆呈红荧光阳性表达的细胞达95%，可用于实验，而非心肌细胞胞浆无阳性表达，见图3B。

Figure 3. Morphology and identification of primary normal cardiomyocytes(×200).A: morphologial characteristics of primary neonatal rat cardiomyocytes; B: the indentification of cardiomyocytes (immunofluorescent staining of α-actin).

图3原代培养的正常乳鼠心室肌细胞的形态及鉴定

6心肌细胞培养液中LDH活性测定

HR组LDH活性较对照组明显升高(83.76±12.21vs16.84±4.43,P<0.05)，说明在HR过程中造成了细胞损伤；与HR组相比，不同浓度GLP-1显著降低LDH活性，见表3。

表3 各组心肌细胞培养液LDH含量、SOD活性和MDA含量的比较

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsHR group.

7心肌细胞凋亡率和坏死率

对照组细胞生长良好，HR组出现大量凋亡细胞，并有部分坏死细胞。给予不同浓度GLP-1预孵育减少了缺氧复氧损伤造成的的凋亡和坏死，凋亡率均较HR组减低，见图4。

图4流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率和坏死率的变化情况

8心肌细胞培养液中MDA含量、SOD活性和ROS测定

与对照组相比，HR组SOD活性明显下降(20.00±4.74vs64.52±6.47,P<0.05)，而MDA含量明显升高(53.74±8.41vs3.90±0.90,P<0.05)，HR使ROS生成升高2倍，GLP-1明显逆转这种改变(P<0.05或P<0.01)，提示GLP-1能减少MDA含量，增加抗氧化物质SOD活力，减少ROS生成，见表3、图5。

9线粒体膜电位检测结果

图6结果显示，对照组线粒体JC-1绿色/红色荧光比值为1.00±0.11，HR组绿色荧光明显增强(1.54±0.33，P<0.05)，不同浓度GLP-1明显减轻线粒体膜电位降低(P<0.05)，见图6。

图5GLP-1抑制HR对ROS生成的促进作用

图6各组线粒体膜电位变化

讨 论

GLP-1作为一种肠促胰岛素，具有促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌、抑制胰高血糖素升高、抑制胃排空及胃动力、增加饱食感、抗胰岛β细胞功能紊乱、刺激胰岛细胞增殖等作用。国外研究发现GLP-1及其类似物可以抑制胰岛β细胞凋亡。Hui等[6]研究表明，GLP-1可以保护小鼠胰岛β细胞瘤株Min6细胞免受过氧化氢诱导的凋亡；GLP-1对包括胰腺β细胞在内的多种靶细胞均有抑制其凋亡的保护作用，而GLP-1受体也存在于心肌细胞，并且GLP-1抑制胰岛β细胞凋亡的途径与心肌细胞的凋亡也有关，因此推测GLP-1对心肌细胞也有类似的保护作用，而且这种保护作用与其抑制心肌细胞凋亡有关[7-9]。

然而Kavianipour等[10]报道在猪心肌梗死模型的研究中，GLP-1对心脏动力学和梗死面积并无影响，因此，关于GLP-1对心肌是否存在保护作用及具体的机制仍有待于进一步研究。本实验采用心肌缺血再灌注模型和体外缺氧复氧模型，给予GLP-1预处理。结果发现与假手术组相比，心肌缺血再灌注组发生心肌梗死，心肌细胞凋亡显著增加；体外实验结果显示与正常对照组相比，缺氧复氧后，LDH活性明显增强，心肌细胞凋亡率显著增加，而体内或体外给予GLP-1预处理，上述指标均发生明显逆转，证实GLP-1对缺血再灌注/缺氧复氧造成的心肌细胞损伤具有保护作用。同时我们发现，缺血再灌注/缺氧复氧诱导的心肌MDA含量增加，而抗氧化物质SOD活性下降，GLP-1预处理可显著逆转这一变化。已有研究表明氧化应激是心肌缺血再灌注损伤的重要机制[11]，氧化应激是指活性分子例如活性氧簇以及活性氮簇等的过度生成和/或清除减少，从而造成体内活性氧类生成与抗氧化防御功能之间平衡的紊乱[12]。SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，是体内主要的抗氧化酶，SOD活力的高低能反映机体抗氧化防御水平。MDA 是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映组织损伤的程度。本实验结果提示，GLP-1对缺血再灌注/缺氧复氧所致心肌损伤的保护作用，可能与其抗氧化作用有关。

线粒体是细胞生死的最终主宰者,研究发现线粒体膜电势能反映电子传递链的性能。动物缺血时线粒体膜电位降低启动细胞凋亡的级联反应，是细胞凋亡的一个早期特征。本研究通过对线粒体超微结构和线粒体膜电位观察发现，GLP-1能减轻IR/HR诱导的线粒体结构和功能变化。

综上所述，GLP-1能够减轻心肌缺血再灌注/缺氧复氧损伤，可能与其抗氧化作用及线粒体结构功能保护作用有关，这为心脏缺血再灌注的细胞保护治疗提供了新的方向。

[1] Nikolaidis LA,Mankad S,Sokos GG,et al. Effects of glucagon-like peptide-1 in patients with acute myocardial infarction and left ventricular dysfunction after successful reperfusion[J].Circulation,2004,109(8):962-965.

[2] Nikolaidis LA, Elahi D,Hentosz T,et al. Recombinant glucagon-like peptide-1 increased myocardial glucose uptake and improved left ventricular performance in conscious dogs with pacing induced dilated cardiomyopathy[J]. Circulation, 2004, 110(8):955-961.

[3] 李 健，冯义柏，郎明健.吡格列酮预处理对大鼠心脏缺血再灌注/缺氧再复氧线粒体结构及膜电势的影响[J]. 中国病理生理杂志，2008,24(4)：720-724.

[4] 邓宇珺，符永恒，谭 宁，等. 大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估[J]. 中国病理生理杂志，2011,27(2):412-416.

[5] Koyama T, Temma K, Akera T. Reperfusion-induced contracture develops with a decreasing [Ca2+]iin single heart cells[J].Am J Physiol,1991, 261(4 Pt 2):H1115-H1122.

[6] Hui H,Nourparvar A,Zao X,et al. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5’-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway[J]. Endocrinology, 2003,144(4):1444-1455.

[7] Bose AK,Mocanu MM,Carr RD,et al. Glucagon-like peptide 1 can directly protect the heart against ischemia/reperfusion injury[J]. Diabetes,2005,54(1): 146-151.

[8] Poornima I,Brown SB,Bhashyam S,et al. Chronic glucagon-like peptide-1 infusion sustains left ventricular systolic function and prolongs survival in the spontaneously hypertensive, heart failure-prone rat [J]. Circ Heart Fail, 2008, 1(3): 153-160.

[9] Mafong DD, Henry RR. The role of incretins in cardiovascular control[J]. Curr Hypertens Rep, 2009, 11(1):18-22.

[10]Kavianipour M, Ehlers MR, Malmberg K, et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36) amide prevents the accumulation of pyruvate and lactate in the ischemic and non-ischemic porcine myocardium[J]. Peptides,2003, 24(4): 569-578.

[11]徐少东，马礼坤，屈朝法，等. 犬急性心肌梗死晚期再灌注对心肌Fas/FasL系统的影响及其可能的氧化应激机制[J]. 中国病理生理杂志，2007,23(2)：307-310.

[12]Heistad DD. Oxidative stress and vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vase Biol, 2006,26(4):689-695.

Effectsofglucagon-likepeptide-1onmyocardialischemia-reperfusion/hypoxia-reoxygenationinjuryinrats

GUO Jia1, BIAN Yun-fei2, WANG Li2, YANG Hui-yu2, XIAO Chuan-shi3

(1ShanxiMedicalUniversity;2DepartmentofCardiology,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity;3DepartmentofCardiology,TheFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:ganxibaozhongxin@sina.com)

AIM: To investigate the effects of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) on myocardial ischemia-reperfusion (IR)/hypoxia-reoxygenation (HR) injury in rats.METHODSSprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups: sham group, IR group and IR+GLP-1 (0.03 nmol/L, 0.16 nmol/L and 0.30 nmol/L) groups. IR group and IR+GLP-1 group were subject to 30 min of ischemia and 3 h of reperfusion. The myocardial infarct size, the ultrastructural changes of the myocardial tissues， the apoptosis of the cardiomyocytes, the activity of superoxide dismutase (SOD) and the concentration of malondialdehyde (MDA) were detected. Primarily cultured cardiomyocytes were divided into 5 groups at random: control group, HR group and HR+GLP-1 (1 μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L) groups. The morphology and apoptosis of the cardiomyocytes were observed. The levels of lactate dehydrogenase (LDH),MDA,SOD,reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP) in different groups were detected.RESULTSCompared with IR group, the myocardial infarct size and cardiomyocyte apoptosis were remarkably reduced, mitochondrial ultrastructures were improved, the activity of SOD was increased and the concentration of MDA was decreased in IR+GLP-1 (0.03 nmol/L, 0.16 nmol/L and 0.30 nmol/L) groups. Compared with HR group, GLP-1 (1 μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L) preconditioning significantly decreased the myocardial injury, increased SOD activity, decreased MDA concentration and ROS production, and heightened MMP in a dose-dependent manner.CONCLUSIONGLP-1 protects cardiomyocytes from IR/HR injury, which may be partially due to the effects of anti-oxidative mechanism and the function of mitochondrial protection.

Glucagon-like peptide-1; Ischemia-reperfusion injury; Hypoxia reoxygenation; Cardiomyocytes; Anti-oxidation; Mitochondrial membrance potential

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.016