杜 静，杨 超，晏耀明，陆 红，周 薇，邹德学

（1.北京大学深圳医院，广东 深圳518036；2.暨南大学第二临床医学院，广东 深圳518020）

肥胖已成为现代生活的流行病和21世纪影响人类健康的主要危险因素之一，深入了解机体甘油三酯合成和动员的调控机制，有助于发现治疗肥胖的新方法。有研究表明一种脂肪特异性AMPK相关蛋白激酶－SIK2，在脂肪细胞的能量代谢中发挥着重要的调节作用［1］。本试验通过前期构建好的SIK2腺病毒表达载体，研究SIK2基因高表达影响3T3－L1成熟脂肪细胞能量代谢的作用及其机制，深入认识脂代谢异常的发病机理，为发现治疗肥胖新的分子靶标提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 3T3－L1细胞系购自 ATCC公司。SIK2腺病毒表达载体由我室构建和鉴定［2］，胰蛋白酶购自GIBCO公司。M－MLV逆转录酶（molony murine leukemia virus reverse transcriptase）购自Promega公司。DMEM和胎牛血清购自GIBCO公司。SIK2、ACC2、FAS、SCD1、GPAT、DGAT1、SREBP1和三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde－3－Phosphate Dehydrogenase ，GAPDH）。PCR 引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪细胞的诱导分化：3T3－L1细胞按常规的贴壁细胞方法培养。在细胞状态良好时，传代分瓶（1×105／ml），细胞接触抑制两天后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液（含0.5 m M 3－异丁基－1甲基黄呤、10μg／ml胰岛素、0.25μM地塞米松）培养两天，换成含10%胎牛血清的DMEM培养液（含10μg／ml胰岛素）培养两天，最后改为含10%胎牛血清的DMEM培养，每两天换液，直至90%的细胞为成熟的脂肪细胞。

1.2.2 SIK2腺病毒载体转染成熟的3T3－L1：脂肪细胞用2.5×1011纯化病毒颗粒／ml SIK2腺病毒和空载体病毒转染成熟3T3－L1脂肪细胞，并以空载体病毒作为阴性对照，更换培养液后在37℃细胞培养箱中继续培养48小时后，收集细胞，提取细胞总RNA。……