甘军纪 魏平华（ 扬州大学兽医学院 江苏扬州 5009 广州格雷特生物科技有限公司 广州 50730）

小鹅瘟 (Gosling plague,GP)是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性和致死性疾病,是目前危害水禽业健康发展的最严重的传染病之一，可造成严重的经济损失。小鹅瘟由方定一教授于1956年在扬州市首先发现，1961年从病死雏鹅体中分离到病毒,并对病毒的各种特性及特异性防治制剂进行深入系统的研究[1-4]。1966年匈牙利学者德金氏(Derzsy′s)用鹅胚首次分离到病毒，1974年，世界家禽协会将该病定名为Derzsy′s 病[4-5]。

1 病原

小鹅瘟病毒属于细小病毒科、细小病毒属成员，病毒颗粒直径20～22nm（图1）[6]，不能凝集禽类、哺乳动物和人类的红细胞[4,7]。病毒对外界因素的抵抗力很强,能抵抗乙醚、氯仿、胰酶、pH 3和56℃3h作用处理。抗原分析表明，国内外所有GPV分离株属于同一个血清型[4,5,8]。GPV可在鹅胚、鸭胚及其细胞上适应和培养。

图1 GPV电子显微镜照片（标尺:100 n m）[6]

GPV实验室感染雏鹅或雏番鸭后，病毒在体内呈广泛分布，尤其在肝、脾、哈德斯腺、胸腺和法氏囊中病毒含量较高[9,10]。因此，病鹅的心血、肝脏、脾脏、脑及肠管和肠内容物均可用于病毒分离。病料用生理盐水或 PBS 研磨制成 1∶5～1∶10 悬液，3000r/min离心10min，每1mL上清加入青霉素、链霉素各1000IU，37℃孵育30min，接种12～14日龄鹅胚绒毛尿囊膜（CAM）或尿囊腔，接种后3～7天，鹅胚死亡。死亡鹅胚病变表现为:CAM增厚并有灰白色坏死点，鹅胚全身充血，翅尖、趾、颈部和喙旁有严重的出血点。肝脏充血及边缘出血，心肌、后脑出血，头部、颈部及两肋皮下均有水肿[4,11]。

2 流行病学

小鹅瘟主要发生于3～30日龄雏鹅。雏鹅通常3～5日龄发病，2～3天迅速蔓延至全群，在7～10日龄发病率和死亡率达到高峰，死亡率50%以上，以后逐渐下降。年龄越小，死亡率越高，可达100%。年龄大的病鹅，其症状较轻，病程较长[4,12]。20世纪80年代后，45～55日龄的鹅有发生典型的小鹅瘟而大量死亡的病例[8]。90年代发现雏番鸭感染GPV病例,发病率50%～70%，病死率达40%～65%[11]。病雏鹅和带毒成年鹅是本病的传染源，在自然情况下主要通过消化道感染。健康雏鹅通过与病鹅、带毒鹅的直接接触或采食被病鹅、带毒鹅排泄物污染的饲料、饮水及接触被污染的用具和环境（如鹅舍、炕坊等）都可以引起本病的传播[4]。

3 临床症状

本病的潜伏期为3～5天。3～5日龄病鹅，通常表现最急性的败血症状，病程只有1天左右,病鹅表现精神委顿、绝食等症状后即告死亡,死亡率可达100%。6～15日龄发病鹅，通常表现为急性型，表现步态不稳，或伏地不肯起立；呼吸困难，鼻孔流浆液性分泌物；腹泻，泄出物呈灰白色或淡黄绿色米泔水状并混有气泡，肛门突出，被毛潮湿并沾有污物；1～2天死亡，濒死前头颈伏地、两肢麻痹，或濒死前扭颈抽搐，或是出现勾头、仰头、角弓反张等神经症状。15日龄以上发病鹅，通常表现为亚急性型，以精神委顿、缩头垂翅、消瘦和拉稀为主，病程为3～7天或更长，少数幸存者能自行康复，但在一段时期内生长不良[2,4]。

4 病理变化

本病的特征性病变是小肠（空肠、回肠）发生急性卡他性-纤维素性坏死性肠炎。肠管外观极度膨大，质地坚实，长约2～15cm，状如香肠[4]。剖开后可见灰色或淡黄色的栓子将肠管全部塞满。切开栓子，中心为深褐色干燥的肠内容物，外面包有纤维素性渗出物和坏死物凝固形成的外衣（图2）。有些病例在小肠内形成带状，似绦虫样纤维素性凝固物。小肠黏膜与假膜脱落后，仍保持其光滑的表面，无溃疡，肠壁菲薄，结构完全破坏。肠壁平滑肌纤维发生实质变性和空泡变性以致蜡样坏死。直肠黏膜肿胀充血，有明显的出血点或出血斑。心肌苍白，心包积液；肝肿胀呈黄色，胆囊肿胀，充满稀黄胆液[4,12-13]。

图2 小肠内形成的栓子将肠管塞满

5 诊断

根据流行病学特征、临诊症状和剖检病变，小鹅瘟一般不难作出诊断，但GP的发生特点已变得不典型，GP过去一般多发生于3周龄以下的雏鹅，现在其发病年龄有增大的趋势，出现非典型或潜伏感染现象，常规诊断方法难以确诊。GP的确诊需借助实验室检查，用于本病实验室诊断的方法有:病毒分离、琼脂扩散试验、ELISA、免疫荧光、中和试验、免疫电镜、核酸探针和PCR等[9,13-15]。实验室诊断方法中，单抗介导的间接免疫荧光试验是检测该病病原特异、简便和快速的诊断方法,能在2h内确诊[7]。Zhang等（2010）利用重组VP3蛋白建立了VP3-ELISA，可以快速、特异检测鹅GPV或番鸭MDPV感染抗体及监测疫苗免疫抗体[16]。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种简单、快速(1～2h)、特异性强和耗费低的核酸扩增技术，可以在等温条件下一步完成。Yang等(2010)成功建立可检测临床GPV感染的LAMP方法,该方法的检测灵敏度达到28拷贝/μL[17]，具有较好的应用前景。

近年来，水禽疫病呈上升趋势，鹅的病毒性疾病除了小鹅瘟以外,又相继出现了雏鹅新型病毒性肠炎、鹅副黏病毒病、鹅禽流感和鹅的鸭瘟等病，在临床病例中既有单一感染,也有混合感染,需进行鉴别诊断。鲜思美等（2009）建立了检测DPV（鸭瘟病毒）、GPV（小鹅瘟病毒）、MDPV（番鸭细小病毒）和GPMV（鹅副黏病毒）等的基因芯片检测方法，该方法对DPV、GPV、MDPV和GPMV的检测具有同步检测和鉴别诊断的功能[18]。

6 病毒的分子生物学

GPV分子生物学研究是新型疫苗研制和新诊断方法建立的基础，近年来在此领域已取得重大进展。

6.1 基因组结构 GPV病毒基因组DNA为单链、线性DNA,大小约5.0kb。GPV基因组中间为编码区，两端为回文序列折叠形成发夹结构，即倒置末端重复序列 (ITR)。中间编码区含有两个开放阅读框架(ORF)，但两个ORF位于同一个读码框，左ORF(LORF)编码NS1、NS2两种非结构蛋白，右侧ORF(RORF)编码 3 种结构蛋白(VP)，即 VP1、VP2 和 VP3，其中VP3是主要衣壳蛋白，约占总蛋白的80%[5,18-19]。万春和等（2011）采用PCR技术扩增获得1株鹅细小病毒株（GoPV）全基因序列(HQ891825)，该病毒全基因大小为5106 nt。GoPV株病毒全基因与欧洲疫苗株 VG32/1（EU583392）相似性最高，高达 98.6%；与匈牙利鹅细小病毒分离株Virulent B(U25479)相似性最低，为 93.6%[20]。GPV 全基因结构见图 3。

图3 GPV基因组结构

6.2 基因组开放阅读框及编码区的排布 GPV正链上有2个相距18nt开放阅读框 (ORF)，基因组左侧ORF编码非结构蛋白。存在2个可能起始密码子，第一个起始密码子ATG位于537nt处，起始大的非结构多肽NS1，第二个ATG位于1065nt处，起始第二个非结构多肽NS2，NS1和NS2共同终止于2420nt处[20]。GPV3个结构蛋白由位于基因组右侧ORF编码，位于 2439nt和3033nt处2个起始密码子（ATG）分别起始VP1和VP3转译。推测VP2是由位于2874nt处不典型的起始密码子ACG起始，这与MDPV、AAV-2的VP2相一致。3个结构蛋白均终止于4637nt处的同1个TAA终止密码子,在其右侧的ITR 前有 1 个 Poly（A）尾[18]。

6.3 倒置末端重复序列（ITR)GPV基因组的两侧各含有长444个核苷酸的倒置末端重复 (ITR)[18,20]。ITR的3’，5’末端的407个核苷酸可折叠形成U形双链发夹结构，发夹结构中含有181个无错配“茎”部和44个碱基的“泡”区，形成了1个形似“箭”状的结构，在箭头上有1个SphⅠ限制性内切酶的酶切位点（GCATGC）。在报道的鹅细小病毒基因中，ITR序列的长短有所不同（381～444nt）[21]。

6.4 病毒基因组编码的结构蛋白 GPV基因组编码3种结构蛋白，即VP1、VP2和VP3。已报道3种蛋白质分子大小与由ORF推测的分子量略有不同，分别为 81.3～88 ku、60～72 ku 和 55～60 ku[16,21-22]。VP1、VP2和VP3蛋白多肽分别由732、587和534个氨基酸残基组成[12]。杆状病毒表达的GPV结构蛋白在昆虫细胞中能够自组装成病毒样颗粒[23]。VP3是GPV主要免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体，是用于构建GPV基因疫苗的理想基因[24-25]。

7 疫苗研究

目前获得注册并取得生产文号的小鹅瘟疫苗主要有3种:小鹅瘟活疫苗（SYG26-35株，种鹅用）、小鹅瘟活疫苗（SYG41-50株，雏鹅用）和小鹅瘟活疫苗（GD株，种鹅用）。

7.1 小鹅瘟活疫苗（SYG26-35株） 1961年分离到小鹅瘟病毒（SYG61株）,SYG61株病毒连续通过易感鹅胚传代14代后对成年鹅无致病力[3-4]。继续在鹅胚上传代至26～35代（SYG26-35）的毒种接种12日龄易感鹅胚用于制造种鹅用疫苗，免疫种鹅的后代雏鹅在3个月内能抵抗小鹅瘟强毒的感染，保护率95%以上。1996年小鹅瘟活疫苗（SYG）获得新兽药证书。

7.2 小鹅瘟活疫苗（GD株） 陈伯伦等（1985）用广东省小鹅瘟强毒株(GB)在鸭胚上连续传代育成1株小鹅瘟鸭胚化GD弱毒株，用GD20-28代毒种接种8日龄鸭胚制备种鹅用疫苗。母鹅在产蛋前1个月注射疫苗后至母鹅270天（日龄）所产的蛋孵出的雏鹅,用强毒攻击,其保护率达100%,270～312天内出壳雏鹅,其保护率只达 82.8%～88.8%[8]。小鹅瘟活疫苗（GD株）已获得新兽药注册。

7.3 小鹅瘟活疫苗（SYG41-50株） SYG61株病毒连续通过鹅胚20代之后对雏鹅无致病力[4]，继续在鹅胚上传代至41～50代（SYG41-50）的毒种接种12日龄易感鹅胚用于制造雏鹅用小鹅瘟疫苗。该疫苗适用于种鹅未经免疫的后代雏鹅,或种鹅免疫时间较长的后代雏鹅作免疫预防。雏鹅出壳48小时内皮下注射适当稀释的疫苗0.1mL（1羽份）。使用疫苗时间愈早愈好，免疫雏鹅1个月内的保护率可达90%以上[1]。

在常规疫苗研究方面，其他研究者也进行了一系列实验室研究。江美娟等（1984）将小鹅瘟病毒（SYG61）鹅胚继代25代的毒株（YG25），再在鸭胚上连续继代18代，获得鸭胚化小鹅瘟弱毒株，其对1日龄的雏鹅无任何不良反应，皮下注射免疫效果显著[26]。陈少莺等（2002）用发病的雏番鸭分离的鹅细小病毒莆田株(GPV-PT株，病毒对1日龄雏番鸭的发病率为100%,死亡率为80%)，在番鸭胚成纤维细胞(MDEFC)连续传代25代，获得鹅细小病毒弱毒疫苗株，用于1日龄雏番鸭免疫，7天后强毒攻击,获得100%保护[27]。程安春等（2005）将 GPV-CHv强毒株通过鹅胚5代，再经10日龄鸭胚连续传代15代,获得GPV鸭胚化弱毒GPV-Cha15株，GPV-CHa15株用0.5 mL的剂量经口服、皮下注射、肌肉注射、滴鼻和静脉注射途径免疫1日龄鹅后无任何不良反应；GPV-CHa15株免疫雏鹅后第3天即可产生较为坚强的免疫保护。母鹅免疫后第15天的后代雏鹅可100%抵抗强毒攻击[11]。

7.4 新型疫苗研究

7.4.1 亚单位疫苗 Ju等（2011）利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中分别表达GPV结构蛋白VP1、VP2和VP3，它们能够自组装成病毒样颗粒（VLPs），VLPs无感染性，但具有良好免疫原性，可作为重组亚单位疫苗[22-23]。GPV VLPs加入50%矿物油佐剂免疫4日龄雏鹅能产生高滴度的中和抗体，抗体滴度高于灭活疫苗和活疫苗[22]。Lee等（2010）利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中分别表达GPV结构蛋白VP2，0.3%二乙烯亚胺（BEI）灭活，以氢氧化铝或 CpG ODNs为佐剂，免疫9日龄鸭，首次免疫后14天进行二次免疫，产生良好抗体应答[28]。

7.4.2 基因工程疫苗 朱德康等（2011）比较小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）和弱毒疫苗免疫鹅的免疫应答，结果表明，pcDNA-GPVVP3免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌和各肠段中表达并能够诱导鹅体产生良好的细胞免疫和体液免疫，基因疫苗免疫鹅血清抗体从第14天开始升高，第28天达最大值，第217天仍然显著高于对照组，基因疫苗诱导鹅体产生免疫应答的能力与弱毒疫苗相当[24]。于志丹等（2008）将GPV-VP3基因和GPMVF基因插入到禽痘病毒基因组的复制非必需区,成功构建了重组鸡痘病毒rFPV-VP3-F[25]，但其在鹅上的免疫效率试验还未见报道。

8 预防与治疗

8.1 种鹅免疫 根据小鹅瘟的流行规律,免疫种鹅使其后代雏鹅从母鹅体获得天然被动免疫力(即母源抗体)是主要的途径，即在产蛋前15～30天,以小鹅瘟活疫苗给种鹅行肌肉注射(1羽份，1mL/只)。从注射疫苗后12～100天,母鹅所产的种蛋孵出的雏鹅,均可获得抵抗小鹅瘟病毒的坚强抵抗力[1,3]。种鹅在产蛋前30天内进行2次活疫苗免疫（间隔2周），雏鹅的保护期可延长至免疫后5个月。

8.2 雏鹅免疫 来源于非免疫种鹅群或免疫后期种群孵化的雏鹅，在出壳后48h内，应用小鹅瘟活疫苗（SYG41-50株）进行免疫，免疫后7天内严格隔离饲养，防止强毒感染。已感染发病的雏鹅进行免疫注射无明显预防效果[1]。

需要注意的是小鹅瘟主要通过污染孵坊传播，因此孵坊中的一切用具和设备在每次使用后，必须清洗消毒。种蛋入孵前需清除表面污染物，用福尔马林熏蒸消毒，尽量不要从疫区引进种蛋和雏鹅。

8.3 治疗 抗小鹅瘟血清或精制高免卵黄抗体用于疫区初生雏鹅紧急预防和患病雏鹅早期治疗,效果极佳。抗血清或卵黄抗体的琼扩效价应在1∶8以上[1]。在小鹅瘟威胁地区，出壳后24h内的雏鹅,每只皮下注射0.3～0.5mL，其保护率达95%以上；紧急预防时，0.5～0.8mL/只皮下注射，保护率达 90%左右；对已发病雏鹅，1mL/只皮下注射，治愈率有 40%～50%[4]；1 月龄以上的病鹅，注射2mL/只，能够控制和扑灭本病的流行。另外可在日粮中加一些抗菌药（环丙沙星、强力霉素等）以防止继发感染，在饮水中加5%葡萄糖及0.05%维生素C增强其抵抗力[29]。

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