胡萝卜素柱层析分离实验最佳材料的探究

2012-10-26武洋

卫生职业教育 2012年7期

关键词：红辣椒柱层析层析

武洋

（平凉医学高等专科学校，甘肃平凉 744000）

胡萝卜素柱层析分离实验最佳材料的探究

武洋

（平凉医学高等专科学校，甘肃平凉 744000）

层析法是近代生物化学中应用较为广泛的物理化学分析方法之一，所以许多学校在生物化学课中开设了吸附柱层析法分离胡萝卜素实验。该项实验用到的实验材料很多，如菠菜叶、胡萝卜、红辣椒等。研究发现，菠菜叶是胡萝卜素柱层析分离实验的最佳材料，实验结果较稳定，每条色带都很清晰。

胡萝卜素柱层析分离实验；最佳材料；菠菜叶

1 层析法

1.1 层析法概述

层析法（Chromatography）是近代生物化学中应用较为广泛的物理化学分析方法之一。1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特将此法用于植物色素的分离，故又称色层分析法，最初命名采用Chromatography这一词来描述这一技术（源于希腊文Chromatos，颜色）[1]。

该法是利用混合物中各组分分子结构互不相同，理化性质（溶解度、吸附力、分子大小形状及分子极性等）各异，因而在支持物（吸附剂）上分布于不同的区带，以达到分离的目的。层析法一般利用两个相，一个称固定相，一个称流动相。目前常用的层析法根据分离原理不同而分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析法等。其中吸附层析法又可根据操作形式的不同分为柱层析法和薄板层析法等[2]。

柱层析法是用一根玻璃柱（1 cm×16 cm）内装吸附剂粉末（MgO、Al2O3、硅胶等），在柱顶部加入要分离的样品溶液，再加入一定的有机溶剂（流动相）以洗脱样品中各组分，由于吸附剂对各组分的吸附力不同及各组分在洗脱剂中的溶解度不同，因而在洗脱过程中各组分随洗脱剂向下流动时，层析柱中连续不断地产生吸附、溶解（解吸附），再吸附、再解吸附的现象。经过一段时间的吸附、解吸附后，样品中各组分即以不同的速度向下移动，逐渐分离，在柱上形成不同的区带，先后从柱下端流出，分步收集，可供进一步鉴定[3]。

1.2 研究的目的与意义

运用层析法可分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物[3]。为了让学生了解柱层析分离法的基本原理及其在生物化学中的应用，许多学校在生物化学课中开设了此项实验。层析法的种类很多，其中利用吸附柱层析法分离胡萝卜素的实验以其所用仪器简单、材料便宜受到教师的青睐。该项实验用到的材料很多，如菠菜叶、胡萝卜、红辣椒等，但每种材料所呈现的最终结果各不相同。到底哪一种材料的实验结果更为清晰、稳定，能让学生一目了然，是本次研究的目的。

2 材料与方法

2.1 实验材料与器材

2.1.1 材料菠菜叶、胡萝卜、红辣椒（湿）。

2.1.2 器材研钵、干燥层析柱、分液漏斗、干燥试管。

2.1.3 主要试剂 95%乙醇，石油醚，2%丙酮石油醚，轻质MgO（干燥110℃～140℃烘烤 2～4 h，粉末状），无水Na2SO4粉末（110℃烘烤）。

2.2 实验方法

2.2.1 实验流程

2.2.2 实验技术要点（1）提取。取擦干的菠菜叶、红辣椒、胡萝卜各10 g分别置于3个研钵中，各加95%乙醇（起破碎细胞作用）10 ml进行研磨，菠菜叶、红辣椒和胡萝卜研磨至糊状，提取液颜色变深后，再各加石油醚19 ml进行萃取[4]，研磨时轻轻搅拌，以防溶液乳化，研磨好后静置一会。取出提取液（上清液），分别置分液漏斗中，缓慢加入1/2体积的蒸馏水洗涤，至水层透明为止（一般洗涤3次），以除去提取液中的乙醇。将3种提取液醚层分别倒入3个干燥试管中，加无水Na2SO4数克去除水分，加塞备用。此时，菠菜叶提取液为深绿色，红辣椒和胡萝卜提取液均为橘黄色。

（2）层析柱的制备。取3根1 cm×16 cm玻璃层析管，底部分别放少量棉花，然后装入MgO粉末，用平顶玻璃棒轻轻压紧，至粉末达8 cm高度，装柱要均匀、无断层，管中MgO粉末要水平。再于柱顶盖以无水Na2SO40.5～1 cm，将柱垂直夹在铁架上备用。

（3）层析。取3种提取液1 ml自柱顶沿管壁加入柱顶表面，待提取液全部进入层析柱时，立即加入含2%丙酮的石油醚3 ml洗脱，使吸附在柱上的各组分逐渐展开成为数条颜色不同的色带。丙酮可增强洗脱效果，但含量不宜过高，以免洗脱过快，使色带分离不清晰[5]。

（4）观察色带。2 min后对3根玻璃层析管中条带进行观察。由于本实验只需观察色带展开情况便可得到所要结果，是一个定性实验，不做定量，所以不进行色素的收集工作。

3 结果与分析

3.1 理论结果

胡萝卜素常与其他植物色素共存于绿叶蔬菜及红辣椒、胡萝卜中，可用乙醇、石油醚及丙酮等有机溶剂提取。当其被MgO吸附时，由于它与其他植物色素的化学结构不同，因此理化性质不同，故可用层析法将其分离。最终色带最下层为胡萝卜素，其上依次为叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。由于胡萝卜素的分子量最小，在固定相中的吸附能力最弱，在洗脱剂中的溶解度最大，故在层析柱内下移速度最快，分布在层析柱的最下端，最先被洗脱下来；叶黄素是胡萝卜素的羟化物，分子量较胡萝卜素大，吸附能力较强，在洗脱剂中的溶解度较小，所以条带在胡萝卜素的上方；再往上是叶绿素a；叶绿素b的分子量最大，吸附能力最强，在洗脱剂中的溶解度最小，所以在最上层。

3.2 实验结果

3种材料实验结果见图1。

图1 3种材料柱层析分离结果

从图1可以看出：材料为菠菜叶时，各条色带清晰，经过几次重复实验后，结果也很稳定，每次均能看出4条清晰色带，尤其是胡萝卜素远远地被分离开；材料为胡萝卜和红辣椒时，经过重复实验发现虽然胡萝卜素含量很高，也能清晰地看到，但由于其他红色的色素过多，与胡萝卜素混在一起，影响了实验结果，不能使学生一目了然，同时其他色素含量较少，也不能清晰地看到。