王洪斌, 成 明, 钱 鹏, 李士虎, 阎斌伦

(1. 淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2. 江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏 连云港 222005;3. 连云港市荣盛生物科技有限公司, 江苏 连云港 222005)

金属离子对中肋骨条藻的胁迫效应及叶绿素a合成的影响

王洪斌12, 成 明3, 钱 鹏1, 李士虎1, 阎斌伦2

(1. 淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2. 江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏 连云港 222005;3. 连云港市荣盛生物科技有限公司, 江苏 连云港 222005)

研究中肋骨条藻(Skeletonema costatum)生长对不同质量浓度的5种金属离子胁迫的响应, 探讨5种金属离子对中肋骨条藻叶绿素a合成的影响。结果显示: 生长方面, 中肋骨条藻对Cd2+和Ba2+的响应较明显, 培养至第10天, Cd2+质量浓度为1、10 mg/L组生长量仅有对照组的59%及43.6%; Ba2+质量浓度为2 mg/L组到第10天是对照组的69.4%, 而0.5 mg/L组超过对照组38.9%; 中肋骨条藻对其他金属离子的胁迫响应不明显; 叶绿素合成方面, Cd2+质量浓度为1 mg/L时, 叶绿素a合成量达最高, 高于对照组157%; 而Ba2+质量浓度为0.5、1 mg/L时, 超出对照组的116%和483%; 其他金属离子对中肋骨条藻叶绿素a合成均起抑制作用, 各个质量浓度组均低于对照组, 其中 Pb2+质量浓度为0.3 mg/L、Mn2+质量浓度为1 mg/L及Li+质量浓度为0.1 mg/L时, 叶绿素a含量达最低值, 仅为对照组的34.1%、37.5%和17.6%; 结论是质量浓度为0.5 mg/L的Ba2+可促进中肋骨条藻的生长及叶绿素的合成, 对其产业化规模培养具有重要意义。

中肋骨条藻(Skeletonema costatum); 金属离子; 胁迫; 响应

由于海洋微藻营养丰富, 富含微量元素和各类生物活性物质, 而且易于人工繁殖, 繁殖周期短, 生长速度快, 所以在医药、保健品、化妆品、水产养殖饵料、饲料添加剂、化工和环保等方面具有广阔的应用前景, 是非常重要的可更新资源[1]。因此, 对海藻的研究和开发利用已经在中国、日本、韩国、智利、瑞典、美国和南非等国家和地区蓬勃开展起来[2-10]。

本实验以中肋骨条藻(Skeletonema costatum)为供试材料, 研究其生长及叶绿素 a合成对不同质量浓度的 5种金属离子的响应, 旨在提示利用藻类富集金属离子及净化金属废水是可行的, 寻找对藻类生长有促进作用的低质量浓度金属离子, 对藻类的纯化和产业化培养具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用微藻中肋骨条藻(Skeletonema costatum)由孙颖颖博士惠赠。海水培养液采用f/2 加富的米勒氏工人海水, 微藻培养所用海水采自连云港高公岛海域(盐度约 31.00~32.00)涨潮时, 醋酸纤维薄膜过滤, 121℃、20 min灭菌待用; 蒸馏水采用一般蒸馏水,灭菌要求同海水, 实验所用的试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 中肋骨条藻培养方法

取20 mL藻种按照1 : 9比例接种至500 mL锥形瓶中, 加入 180 mL灭过菌的蒸馏水, 摇匀, 共接种5瓶, 然后放入光照培养箱中培养。温度22 , ℃光强3 000 lx, 光暗比12 h : 12 h。每日定时摇动培养瓶3次, 防止藻细胞贴壁生长(如未做特别说明, 后续实验培养条件均与之相同)。摇瓶时随机调换锥形瓶的顺序, 以减少误差。

1.2.2 中肋骨条藻生长测定

取培养至第 4天的藻液, 分别加入不同质量浓度的金属盐溶液, Pb2+质量浓度设置为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 6个梯度, Cd2+设置为 0、0.1、0.5、1、2、10 mg/L 6 个梯度, Mn2+、Li+、Ba2+质量浓度分别设置为 0、0.1、0.5、1、2、5 mg/L 6种梯度, 其他成分含量不变, 蒸馏水作为空白对照, 采用分光光度法测定其在680 nm处的生长量, 记录数据, 直到第10天为止。

比生长速率计算:K= (lnNt-lnN0)/T。其中K为相对增长速率,N0为藻液起始质量浓度,Nt为培养t时间后的藻液质量浓度,T为培养时间(h)。

1.2.3 中肋骨条藻叶绿素a含量测定

采用热乙醇萃取分光光度法[11], 取10 mL培养至20 d的藻液, 5℃、6 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 取沉淀－20℃下冷冻12 h。取出后迅速用9 mL 95%乙醇(80)℃于80℃热水浴萃取2 min, 再用超声波清洗仪超声振荡处理10 min, 于4℃黑暗静置6 h后, 5℃、6 000 r/min离心5 min, 取上清, 用分光光度计于波长 665 nm和 750 nm测定A值, 加入 1 mol/L盐酸酸化, 于波长665 nm和750 nm处再测定A值。

2 结果与分析

2.1 中肋骨条藻生长及生长速率对不同质量浓度的金属离子的响应

2.1.1 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Cd2+的响应

由图 1可知, 实验组的生长情况都要差于对照组, 以10 mg/L组最为明显, 在第7天出现高峰, 然后下降, 到第10天, 10 mg/L组的生长量只有对照组的43.6%。对照组的生长量一直处于上升状态, 0.1、0.5、1 mg/L和2 mg/L实验组生长量在第10天分别是对照组的74%、67%、59%和72%。

图1 中肋骨条藻生长量对不同质量质量浓度Cd2+的响应Fig. 1 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Cd2+

2.1.2 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Pb2+的响应

由图2得知, Pb2+质量浓度0.4 mg/L时, 对中肋骨条藻生长的影响最为明显, 整个培养过程, 0.4 mg/L实验组生长量始终低于对照组; 其他质量浓度实验组对中肋骨条藻生长的影响不明显, 仅显示微弱的抑制作用。所有实验组的比生长速率均小于对照组。

图2 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Pb2+的响应Fig. 2 Response of the growth of Skeletonemacostatum to different concentrations of Pb2+

2.1.3 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度 Mn2+的响应

从图3可以看出, 随着培养时间的增加, 各质量浓度实验组与对照组之间的差距越来越小, 到第 10天, 各组的生长量基本一致。仅0.1 mg/L和5 mg/L实验组的生长量始终低于对照组, 尤其是5 mg/L组,到第 5、6天, 生长量只有对照组的 67.4%, 至第 10天仅显示微弱抑制作用。

0.1 mg/L组的比生长速率最低, 为对照组的94.4%。

图3 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Mn2+的响应Fig. 3 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Mn2+

2.1.4 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Li+的响应

由图4可知, 2 mg/L和5 mg/L实验组对中肋骨条藻生长影响明显, 显示出较好的抑制效果, 到第10天, 两组生长量分别是对照组的74%、71%, 而且在整个培养过程中, 始终低于对照组。所有实验组的比生长速率都要低于对照组, 2 mg/L组比生长速率最低, 仅为对照组的76.9%, 其余4组的比生长速率与对照组相差不大。

图4 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Li+的响应Fig. 4 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Li+

2.1.5 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Ba2+的响应

由图5可知, 0.1、0.5 mg/L和1 mg/L实验组生长量始终高于对照组, 以0.1、0.5 mg/L组最为明显,到第10天, 生长量超出对照组的36%、39%。2 mg/L实验组生长量一直低于对照组, 第10天仅是对照组的69%。0.1 mg/L和0.5 mg/L两组生长量之间差距很小, 生长量随着培养时间的增加而上升。比生长速率在0.1 mg/L时达到顶峰, 高于对照组25.5%, 然后随着质量浓度增加而逐渐下降, 在2 mg/L时达到最低值, 为对照组的66%。

图5 中肋骨条藻生长量对不同质量浓度Ba2+的响应Fig. 5 Response of the growth of Skeletonema costatum to different concentrations of Ba2+

2.2 中肋骨条藻叶绿素 a含量对不同质量浓度的金属离子的响应

由图6得知, 叶绿素a含量在Cd2+质量浓度0.1 mg/L和 10 mg/L时达到最低值, 仅为对照组的57.1%, 在1 mg/L时达到最大值, 高于对照组157%。由图7看出, Pb2+对叶绿素a含量影响较为明显, 波动幅度较大, 0.1、0.2、0.3 mg/L和0.4 mg/L实验组叶绿素a含量均小于对照组, 在0.3 mg/L时达到最小值, 仅为对照组的34.1%。

从图8可知, 所有实验组的叶绿素a含量均小于对照组, 1 mg/L组叶绿素a含量最低, 仅为对照组的37.5%。5 mg/L组叶绿素a含量为对照组的45.8%。说明Mn2+对中肋骨条藻叶绿素a合成起抑制作用。由图9得知: 0.5 mg/L组叶绿素a含量最大, 高于对照组2.9%。其余4组叶绿素a含量均小于对照组, 其中0.1 mg/L组叶绿素a含量最小, 仅仅是对照组的17.6%。

0.1 mg/L组叶绿素a含量小于对照组, 为对照组的83.3%, 其余4组叶绿素a含量均大于对照组, 其中0.5 mg/L组的生长量高于对照组117%, 1 mg/L组叶绿素a含量最大, 为对照组5.8倍之多。Ba2+对中肋骨条藻叶绿素 a合成起很好的促进作用, 结果见图10。

图6 中肋骨条藻叶绿素a含量对不同质量浓度Cd2+的响应Fig. 6 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different Concentrations of

图7 中肋骨条藻叶绿素a含量对不同质量浓度Pb2+的响应Fig. 7 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Pb2+

3 讨论

图8 中肋骨条藻叶绿素a含量对不同质量浓度Mn2+的响应Fig. 8 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different Concentrations of Mn2+

图9 中肋骨条藻叶绿素a含量对不同质量浓度的Li+响应Fig. 9 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Li2+

图 10 中肋骨条藻叶绿素 a含量对不同质量浓度 Ba2+的响应Fig. 10 Response of the Chlorophyll a content in Skeletonema costatum to different concentrations of Ba2+

在生长方面, 5种金属离子对中肋骨条藻的生长均有一定程度的胁迫作用, 5种金属离子对中肋骨条藻的生长抑制作用强度顺序: Cd2+>Pb2+>Mn2+>Li+>Ba2+。到第10天, Cd2+质量浓度1、10 mg/L组生长量仅有对照组的59%及43.6%, 这与何学佳等[12]和周银环等[13]的研究结果不一致, 原因有待于进一步研究。0.5 mg/L的Cd2+对中肋骨条藻的抑制比较明显, 这与张亚楠[14]等的研究一致, 这说明高质量浓度的 Cd2+对藻类生长有明显的抑制作用。培养至第7天, Pb2+质量浓度0.1 mg/L组的生长量与对照组的生长量基本一致, 0.4 mg/L组的生长量为对照组的87.4%, 这与张莹莹等[15]研究的结果相一致。Mn2+质量浓度0.1~5 mg/L时的生长量基本上均小于对照组,这与黄振芳[16]等研究的结果不一致, 可能是藻种遗传属性差异所致。到第10天, Ba2+2 mg/L组的生长量只有对照组的 69.4%, 这说明高质量浓度的 Ba2+对中肋骨条藻有一定的抑制作用。

在叶绿素 a合成方面, 高质量浓度的 Cd2+抑制叶绿素a的合成, 这与石磊等[17]的研究相一致。Mn2+质量浓度为1 mg/L时叶绿素a含量最低, 仅为对照组的 37.5%, 5 mg/L组叶绿素 a含量为对照组的45.8%。由于Mn是叶绿体的结构成分, 缺Mn会导致叶绿体结构被破坏, 甚至解体。但质量浓度过高时,由于藻类细胞壁带有负电荷和氨基—羟基等官能团,这些结构特点决定了对带有正电荷的金属离子具有吸引富集的作用, Mn同细胞表面的O, S和N结合,生成稳定的络合物, 从而使细胞表面许多活性基团丧失生物活性, 进而抑制了藻细胞的光合作用和生长。Li+为0.1 mg/L时叶绿素a含量最小, 仅仅是对照组的17.6%, 而Ba2+为1 mg/L时叶绿素a含量最大, 为对照组5.8倍之多。5种金属离子对中肋骨条藻的叶绿素 a抑制作用强度顺序是 Mn2+>Li+>Pb2+>Cd2+> Ba2+。

本实验采用了热乙醇萃取分光光度法。丙酮法的测定过程比较繁杂, 其中样品研磨需花费大量时间和精力, 且不容易将浮游植物细胞完全磨碎, 影响到叶绿素 a 的萃取效率。而乙醇法由于样品经过冷冻和快速热水浴提取, 运用冷热差以及超声波的粉碎作用将浮游植物细胞破碎, 且热溶液的萃取效果高于冷溶液, 对叶绿素a的萃取较完全, 且省时省力。不过, 过高的温度会破坏叶绿素 a, 在操作时必须严格控制水浴温度(80)℃和热萃取时间(2 min), 防止过高温度破坏叶绿素 a 而影响测定结果。另外乙醇对人体的毒害远小于丙酮, 长期使用丙酮萃取分光光度法对操作者的毒害较大, 所以使用热乙醇萃取分光光度法比较合适。

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The stress effects of metal ions on Skeletonema costatum and the influences on chlorophyll a synthesis

WANG Hong-bin1,2, CHENG Ming3, QIAN Peng1, LI Shi-hu1, YAN Bin-lun2
(1. College of Marine Sciences, HuaiHai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Lianyungang 222005,China; 3. Lianyungang Rongsheng biotechnology Co.Ltd, Lianyungang 222005, China)

Dec.,12,2011

Skeletonema costatum; meta lions; stress; response

The responses of Skeletonema costatum to different concentrations of 5 metal ions stress and their influences on chlorophyll a synthesis in S. costatum were investigated. The results showed that S. costatum had significant responses to Cd2+and Ba2+. After 10-day culture, the growth of the 1 mg/L and 10 mg/L Cd2+groups was only 59% and 43.6% of the control group respectively. The S. costatum quantity in 2 mg/L Ba2+group was 69.4% of the control group.In contrast, the quantity of the 0.5 mg/L Ba2+group was 38.9% more than the control group . The stress effects of other metal ions were not significant. In terms of chlorophyll a synthesis, when the Cd2+concentration was 1 mg/L, the chlorophyll a quantity was the highest, which was 157% higher than the control group. With, the chlorophyll a quantities in 0.5 mg/L and 1 mg/L Ba2+groups were 116% and 483% higher than the control group. The other metal ions all inhibited chlorophyll a synthesis and the chlorophyll a quantities in all the other groups were lower than the control group. The chlorophyll a quantities of 0.3 mg/L Pb2+, 1 mg/L Mn2+and 0.1 mg/L Li+groups were very low and were only 34.1%、37.5% and 17.6% of control group. In summary, 0.5 mg/L Ba2+can promote the growth of S. costatum and its chlorophyll a synthesis and this is very important to the large scale culture of S. costatum.

X55

A

1000-3096(2012)07-0104-05

2011-12-12;

2012-02-13

国家星火计划项目(2010GA690170)

王洪斌, (1966-), 男, 副教授, 理学硕士, 主要从事微生物学及基因工程的教学与科研工作, E-mail: whbvirus@126.com

(本文编辑：梁德海)