胡梁斌,王淼焱,李洪波,丁丁,李小雪

（河南科技学院,河南新乡453003）

黄曲霉菌Aspergillus flavus产生的黄曲霉毒素（aflatoxin）是目前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一,被国际癌症研究所确定为一级人类致癌物.黄曲霉毒素通过原料、粮食产品的加工储藏,以及污染动物饲料等环节污染粮源性食品、食用油类以及畜禽类产品[1-3].鉴于黄曲霉毒素污染给我国造成的重大经济损失以及对人们健康的威胁,科研人员一直在寻求能控制黄曲霉毒素污染的有效策略.

2005年,Reverberi等报道香菇Lentinus edodes中的多糖提取物能够抑制寄生曲霉A.parasiticus产生黄曲霉毒素,可能是多糖提取物中的β-葡聚糖激活了与氧化胁迫反应相关的转录因子hsf-2,并且延迟了黄曲霉毒素产生相关基因afIR和norA的转录[4].2006年,Zjalic等[5]发现白腐菌Trametes versicoior产生的β-葡聚糖也能够抑制黄曲霉毒素的合成,再次展现了β-葡聚糖在黄曲霉毒素控制中的应用前景.目前所有的数据都指出真菌中的β-葡聚糖很可能能够抑制黄曲霉毒素.2010年,河南科技学院食品学院实验室研究了香菇多糖、海带多糖、石耳素等十余种多糖对黄曲霉生长及产毒的抑制作用,发现香菇纤维素虽与花生壳纤维素结构相似,但香菇纤维素能够显著抑制黄曲霉毒素产生.深入研究后发现了香菇纤维素的一种衍生物有着超强的抑制黄曲霉菌产毒活性.通过鉴定发现,该衍生物为单一组分的糖蛋白,我们将该物质命名为GPX（glycoprotein-x）.

响应面分析法（response surface methodology,RSM）是利用合理的试验设计,采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法[6-7].为了提高香菇纤维素衍生物GPX的提取率,我们在单因素试验基础上,采用响应面法分析优化该种香菇纤维素衍生物GPX的制备工艺条件.这为控制黄曲霉毒素污染的多糖制剂的研发提供了理论基础,而且有助于我们早日实现具有自主知识产权的绿色多糖型黄曲霉毒素控制制剂的工业化生产.

1 材料与方法

1.1 试验材料

香菇纤维素：香菇购自新乡市胖东来生活广场,干燥后粉碎过60目筛,经水洗、酸洗等处理后自提制得香菇纤维素,置于干燥器内保存备用；体积分数为95%的乙醇、无水乙醇、体积分数为98%的浓硫酸等,均为分析纯.

1.2 试验方法

本试验是以提取的香菇水不溶性纤维素为原料,高温制备GPX,采用响应面分析法（RSM）优化制备的工艺条件,以达到提高香菇纤维素衍生物GPX提取率的目标.

1.2.1 香菇水不溶性纤维素提取 称取一定量的干燥香菇,粉碎,粉末水洗3～4次后挤干水分,按料液比1 g∶10～13 mL加入稀硫酸溶液,料液pH值为1.5,于（85±5）℃下浸提1.5～2.0 h,趁热过滤,热水洗涤滤渣.滤渣水洗至中性,用体积分数为5%的H2O2漂白,干燥、打粉、过筛获得香菇水不溶性纤维素[8].

1.2.2 GPX的单因素试验 选取提取温度、液固比、提取时间、提取次数4个可能影响提取效果的因素做单因素试验,以GPX的提取率为指标值,确定相关因素的影响并为后续的响应面提供各因素的取值范围.

加热温度对GPX提取率的影响：精确称取2 g香菇水不溶性纤维素,选择提取温度分别为70、85、100、115、130℃,固定液固比为150、提取时间20 min、提取1次,然后过滤冷冻干燥,计算提取率,观察温度对提取率的影响.

液固比对GPX提取率的影响：精确称取2 g香菇水不溶性纤维素,选择液固比分别为50、100、150、200、250,固定提取温度为130℃、提取时间20 min、提取1次,然后过滤冷冻干燥,计算提取率,观察液固比对提取率的影响.

提取时间对GPX提取率的影响：精确称取2 g香菇水不溶性纤维素,选择提取时间分别为5、10、15、20、25 min,固定提取温度为130℃、固液比为150、提取1次,然后过滤冷冻干燥,计算提取率,观察提取时间对提取率的影响.

提取次数对GPX提取率的影响：精确称取2 g香菇水不溶性纤维素,固定提取温度为130℃、固液比为150、提取时间20 min,分别提取1、2、3、4次,然后过滤冷冻干燥,计算提取率,观察提取次数对提取率的影响.

1.2.3 GPX的响应面优化试验 根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,结合单因素试验结果,使用设计专家软件Design-Expert.8.05b中的响应面设计法（RSM）,选取提取温度、液固比、提取时间3因素3水平共17个试验点（包括3个中心点）的响应面分析试验,以求出数学模型,并进而得到最优的制备工艺条件[9].

表1 响应面试验的因素与水平设计Tab.1 Response surface experimental factors and level design

1.2.4 GPX的提取率 采用重量法[10]确定：GPX提取率/%=（GPX的质量/香菇纤维素质量）×100.

2 结果与分析

2.1 GPX制备的单因素试验结果

选取提取温度、液固比、提取时间、提取次数等4个可能影响制备效果的因素做单因素试验,以GPX的提取率为指标值,确定相关因素的影响并为后续的响应面提供各因素的取值范围.

2.1.1 提取温度对GPX提取率的影响 固定液固比为150、提取时间20 min、提取次数为1,改变加热温度以观察其对提取率的影响,结果见图1.

图1 加热温度对GPX提取率的影响Fig.1 The influence ofextract temperature on extraction rate

由图1可知,随着温度的上升,GPX的提取率逐渐提高.温度对GPX提取率影响很大.考虑到实验室条件限制,将响应面试验中的温度变化范围定为100～130℃.

2.1.2 液固比对GPX提取率的影响 固定提取温度130℃、提取时间20 min、提取次数为1,改变液固比以观察其对提取率的影响,结果见图2.

图2 液固比对GPX提取率的影响Fig.2 The influence ofmaterial-fluid ratio on extraction rate

由图2可知,随着液固比的增大,提取率逐渐上升,当液固比超过200时,提取率几乎不再变化,出于冷冻浓缩的考虑,将响应面试验中液固比的变化范围定为100～200.

2.1.3 提取时间对GPX提取率的影响 固定提取温度130℃、固液比为150、提取次数为1,改变提取时间以观察其对提取率的影响,结果见图3.

图3 提取时间对GPX提取率的影响Fig.3 The influence ofextract time on extraction rate

由图3可知,提取时间超过20 min后提取率保持恒定,而5 min提取率较低,综合考虑将响应面试验中提取时间的变化范围定为10～20 min.

2.1.4提取次数对GPX提取率的影响 固定提取温度130℃、固液比为150、提取时间为20 min,改变提取次数以观察其对提取率的影响,结果见图4.

图4 提取次数对GPX提取率的影响Fig.4 The influence ofextraction times on extraction rate

由图4可知,不同的提取次数,提取率几乎不变,相对恒定,继续增加提取次数,没有太多意义,故提取次数定为1次.

2.2 GPX制备的响应面试验结果

选取提取温度、液固比、提取时间3因素3水平共17个试验点（包括3个中心点）的响应面分析试验,结果见表2.

表2 响应面试验设计与结果Tab.2 Response surface experimental design and results

采用Design-Expert.8.05b软件对响应值与各因素进行多元回归拟合,得到以GPX提取率为目标函数的二次回归方程为：

式中：A为提取温度/℃,B为液固比,C为时间/min.

表3为方差分析表.由表3可知,该模型的F值为119.62,表明该模型是显著的.“Pro＞F”值如果小于0.05说明对应的因素对响应值影响显著.提取温度、液固比、提取时间的“Pro＞F”值分别为＜0.000 1、0.040 5、0.012 1,表示对提取率的影响均显著.图5、图6、图7分别显示了提取温度与液固比、提取温度与时间、提取时间与液固比各自的交互作用对GPX提取率影响的拟合结果.

表3 方差分析表Tab.3 Analysis ofvariance table

图5 提取温度与液固比的交互作用对GPX提取率影响的拟合结果Fig.5 The fitting resultofthe influence ofinteraction between extracttemperature and material-fluid ratio to the extraction rate ofGPX

图6 提取温度与时间的交互作用对GPX提取率影响的拟合结果Fig.6 The fitting result of the influence of interaction between extract temperature and time to the extraction rate ofGPX

图7 提取时间与液固比的交互作用对GPX提取率影响的拟合结果Fig.7 The fitting result of the influence of interaction between extract time and material-fluid ratio to the extraction rate ofGPX

2.3 GPX制备条件优化

使用Design-Expert 8.05b优化GPX制备条件,设定的求解条件见表4（提取次数为1次）.表5为Design-Expert软件给出的GPX制备的最优条件（提取次数为1次）,表6是对最佳工艺条件的验证.由表6可见实际的平均提取率与理论提取率极为接近.

表4 Design-Expert软件预测期望值的求解条件Tab.4 Solution conditions for expected value given by Design-Expert

表5 Design-Expert软件给出的GPX制备的最优条件Tab.5 The optimal preparation condition ofGPX given by Design-Expert

表6 对最佳工艺条件的验证Tab.6 Verification of the optimum conditions

综上所述,对回归模型进行分析,得出香菇纤维素衍生物GPX的最优制备工艺条件为：提取温度130℃、液固比200、提取时间20 min、提取次数1次.在验证实验中GPX的平均提取率为1.66%.

3 小结

响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值,只能精确到某一个具体的水平点,而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷[11].根据Box-Behnken中心组合设计法及响应面分析法,利用Design expert 8.05b软件,对GPX制备进行优化,并且表明了该方法真实可信.通过该方法得出最佳制备工艺为：提取温度130℃、液固比200、提取时间20 min、提取次数1次.在此条件下GPX提取率为1.66%,比优化前单因素试验的提取率有很大提高,表明利用响应面分析法优化GPX制备是可行的.这为控制黄曲霉毒素污染的多糖制剂的研发提供了理论基础,有助于早日实现我们具有自主知识产权的绿色多糖型黄曲霉毒素控制制剂的工业化生产,为防治黄曲霉毒素提供了有效的方法.

[1]Liang X Q,Luo M,Guo B Z.Resistance mechanisms to Aspergillus falvus infection and Aflatoxin contamination in peanut[J].Plant Pathology Journal,2006,5（1）：115-124.

[2]苏志.黄曲霉毒素的危害[J].食品安全,2006（3）：44-45.

[3]王长宇.食品中黄曲霉毒素的处理措施[J].中国新技术新产品,2010（5）：8.

[4]Lay F T,Brugliera F,Anderson M A.Isolation and properties of floral defensins from ornamental tobacco and petunia[J].Plant Physiology,2003,131（3）：1283-1293.

[5]Reverberi M,Fabbri A A,Zjalic S,et al.Antioxidant enzymes stimulation in Aspergillus parasiticus by Lentinula edodes inhibits aflatoxin production[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2005,69（2）：207-215.

[6]Zjalic S,Reverberi M,Ricelli A,et al.Trametes versicolor：a possible tool for aflatoxin control[J].International Journal ofFood Microbiology,2006,107（3）：243-249.

[7]杨红玲,吴鸣建,张宏韬,等.射干黄酮提取工艺的响应面设计优化[J].食品科技,2009,34（3）：188-192.

[8]詹耀才,钟细娥,高展炬.麦麸加工下脚料提取纤维素、半纤维素的工艺研究[J].粮食加工,2008,33（6）：28-30.

[9]闫克玉,高远翔.响应面分析法优化槐米总黄酮的提取工艺[J].食品研究与开发,2009,30（7）：21-24.

[10]郝晓宏,韩琼.水溶性多糖3种测定方法的探讨[J].山西职工医学院学报,2003,13（1）：2-4.

[11]杨文雄,高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂,2005（2）：68-71.