海带中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺评价模型的建立与探讨

2012-10-13曲桂燕汪东风韩丽君

海洋科学 2012年11期

曲桂燕, 刘旭, 汪东风, 袁毅, 韩丽君

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东青岛266003; 2. 中国科学院海洋研究所, 山东青岛266071;3. 安徽农业大学茶与食品科技学院, 安徽合肥 230036)

岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan), 又名岩藻多糖或褐藻糖胶, 是一种水溶性的硫酸杂多糖, 普遍存在于褐藻和一些棘皮动物中。研究发现岩藻聚糖硫酸酯具有抗凝血[1]、抗氧化[2]、抗肿瘤[3-4]、抗病毒[5-7]等多种生物学活性, 并且随着其应用价值的不断提升,需求量也在增加。因此如何提高岩藻聚糖硫酸酯中主要成分的提取率是对其进行产业化利用的关键。

岩藻聚糖硫酸酯的主要成分除了L-岩藻糖和硫酸根外, 还含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质等, 越来越多的研究表明, 其活性与硫酸根含量和位置[2,5]密切相关。不同的提取方法、提取工艺条件对岩藻聚糖硫酸酯得率有很大影响, 而且对其多糖含量与硫酸根含量的影响不同。虽然刘红英等[8]和李兆新等[9]对岩藻聚糖硫酸酯的含量测定进行了一些探讨, 但由于其组成复杂还没有标准方法。因此在提取纯化过程中, 评价指标也各不相同,大部分用粗多糖质量[10-18]、粗多糖中多糖含量[19-22]来表示。其他的评价方法有: 根据刘红英的方法测定岩藻多糖的含量[23-24]; 根据多糖和硫酸根的总质量分数[25]来评价; 对多个单独指标[23-24,26-31]进行综合考虑。为了得到合理的优化结果, 需要恰当的评价指标, 但很少有人关心评价指标对因素选择的影响。

由于岩藻多糖主要由岩藻糖和硫酸根组成, 这两者的成分含量对岩藻多糖的活性起很重要的作用,本文以粗多糖提取率(%)、岩藻糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的加权评分为指标通过均匀设计试验来优化提取工艺并系统分析各实验因素对不同指标的影响, 从而有目的地指导生产。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 试验材料与试剂

海带由山东日照洁晶集团提供, 于2011年8月在山东荣成采集。将海带洗净、40℃烘干、磨碎、过100目筛后, 贮存于密闭玻璃瓶中备用。

95%乙醇; K2SO4、BaCl2、明胶、浓盐酸;L-半胱氨酸盐酸盐、浓硫酸以上试剂均为国产分析纯。标准品:L-岩藻糖(Fuc)(Sigma)。

1.1.2 仪器

ADVENTURERTM系列电子天平, 奥豪斯仪器(上海)有限公司; DF-101集热式恒温加热磁力搅拌器, 郑州长城科工贸有限公司; SC-3610低速离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司; RE-2000旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂; LGJ-12冷冻干燥机, 北京松源华兴科技发展有限公司; UV-2000型分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司; 数显恒温水浴锅 HH-4国华电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺流程

干海带经热水浸提后, 再经离心、浓缩、醇析、冷冻干燥, 得到岩藻聚糖硫酸酯粗品, 称重后计算得率, 并测定岩藻糖和硫酸根含量。其工艺流程如图1所示。

图1 海带岩藻聚糖硫酸酯提取工艺流程图Fig. 1 The flow chart of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica

Yw: 粗多糖提取率(%)=粗多糖的质量/藻粉的质量×100%

Yf: 岩藻糖提取率(%)=(粗多糖的质量×岩藻糖的百分含量)/藻粉的质量×100%

Ys: 硫酸根提取率(%)=(粗多糖的质量×硫酸根的百分含量)/藻粉的质量×100%

1.2.2 测定方法

岩藻糖含量测定[32]: 采用 Gibbons比色法测定多糖中L-岩藻糖含量。得回归方程:y=0.0009x-0.0015,R2=0.9934。

硫酸根含量测定[33]: 采用 Dodgson比浊法测定多糖中硫酸根含量。得回归方程:y=2.6999x+0.0062;R2=0.9969。

1.2.3 提取试验设计

在前期预实验和参考文献[11,13,15,17,21,25]的基础上, 选择影响提取效果的 3个主要因素: 浸提温度(X1)、浸提时间(X2)、液料比(X3)进行考察, 并以粗多糖提取率(Yw)、岩藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)为评价指标。

各因素分别选择6个水平, 因素水平见表1。根据表1 的因素及水平, 选用均匀设计表U12* (123),并通过拟水平法适当改造, 依据规定[34-35]使用, 其均匀性D=0.183 8。

1.2.4 数据处理

采用 Minitab软件对实验数据进行逐步回归分析, 筛选显著变量, 建立回归方程, 并通过回归方程进行规划求解, 从而得到优化的海带岩藻多糖提取条件。

2 结果与讨论

2.1 试验方案及分析结果

表1 因素水平表Tab. 1 The factor-level list for uniform design

采用水提法从海带中提取岩藻聚糖硫酸酯, 以粗多糖提取率(Yw)、岩藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)为评价指标指标, 并采用综合加权评分法综合考虑各试验因素对以上三个指标的影响。综合加权评分法是在多指标的优化试验中, 根据每个指标优选的条件可能会相互矛盾, 对某一指标的有利的条件可能对其他指标不利, 因此试验中引入一个综合指标, 来考察指标的综合效果。根据各指标的重要性,将粗多糖提取率( %)、岩藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)的权重系数分别设定为0. 1, 0. 45,0. 45。为在统一标准下加权评分, 分别将最好的试验结果定为100, 其他试验结果采用适宜的公式酌情记分。根据选定的均匀设计表, 在各组条件下进行实验, 结果见表2。

2.2 各实验因素对单个评价指标 Yw、Yf和Ys的影响

2.2.1 优化数学模型的建立

利用Minitab 16统计软件分别对粗多糖提取率(Yw)、岩藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)进行回归分析, 采用二次型回归模型, 自变量X1,X2,X3采用中心化处理[35], 并采用逐步回归的方法筛选变量,得到回归方程及其显著性检验如表3所示。

表2 热水提取岩藻聚糖硫酸酯均匀设计试验方案及分析结果Tab. 2 Conditions and analysis results of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica by uniform design

表3 Yw、Yf和Ys的回归方程及其显著性检验Tab. 3 Results and significance tests of quadratic polynomial stepwise regression of significance tests of Yw、Yf and Ys

在上述模型中P值都小于 0.05, 说明回归方程在α=0.05水平上显著, 模型方程具有统计学意义,整体拟合效果不错。但模型Yw的显著性P=0.029比模型Yf和Ys要小, 同时模型Yw的复相关系数r=0.811, 决定系数R2=0.658, 说明模型方程预测精度较低。由于本实验没有进一步纯化, 存在褐藻胶的干扰, 所以单纯以沉淀物干重计算得率会有很大偏差。而以岩藻糖和硫酸根含量计算提取率得到的回归模型拟合较好, 说明评价指标对优化工艺上有很大影响。

2.2.2 因素效应分析

通过t检验得到各相关系数的显著性检验结果如表 4所示。从表中可以看出各实验因素对评价指标的影响大小。

从表4中可以看出各试验因素对Yw的影响大小为X1>X3>X1X2, 其中X1提取温度对粗多糖得率影响最显著, 其次是X3液料比, 而X2提取时间影响效果不显著, 且与温度的交互作用对其有负面影响; 对Yf的影响大小为X12>X2X3>X1, 其中X12提取温度的二次项对岩藻糖提取率的影响最显著, 其次是X2X3的交互作用, 而X2、X3单独影响效果不显著; 对Ys的影响大小为X1>X32>X1X2>X22>X3, 其中X1提取温度对硫酸根得率的影响最显著, 其次是X3液料比的二次项, 而X2提取时间影响效果不显著。

表4 Yw、Yf和Ys偏回归系数的显著性检验Tab. 4 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression models of Yw, Yf and Ys

经上述分析发现, 提取温度(X1)对粗多糖提取率(%)、岩藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)影响都最显著, 液料比(X3)对粗多糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的影响都较显著, 而提取时间(X2)影响效果不显著, 且其交互作用都存在负面影响。因此各实验因素对岩藻糖含量与硫酸根含量的影响不同, 需综合考虑。

2.3 各实验因素对加权评分的影响

2.3.1 优化数学模型的建立

按2.2.1对加权值Y进行回归分析, 得到回归方程:Y= 65.2 + 0.555x1+ 1.73x2+ 0.587x3+ 0.0236x12+0.0939x32-0.110x1x2;其中x1=X1-75.0,x2=X2-3.5,x3=X3-22.5。

模型的复相关系数R=0.944;F=6.85,p=0.026<0.05, 说明回归方程在α=0.05水平上显著,模型方程具有统计学意义, 整体拟合效果不错。模型的决定系数R2=0.892, 调整决定系数R2=0.762, 说明模型方程具有较高的预测精度。并且通过加权值Y得到的回归方程与通过Yw、Yf和Ys得到的回归方程相比其预测精度有了很大的提高, 因此, 该模型预测热水浸提岩藻多糖的工艺参数是可行的。

2.3.2 因素效应分析

通过 t检验得到各相关系数的显著性检验结果如表5所示。从表5中可以看出对加权值Y的影响大小为X1>X32>X12>X3>X1X2>X2, 其中X1提取温度对总提取率的影响最显著, 其次是X3液料比的二次项, 而X2提取时间的单独影响效果不显著。

表5 加权值Y偏回归系数的显著性检验Tab. 5 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression model of Y

2.4 工艺条件参数优化

根据加权评分Y得到的回归方程进行规划求解,并结合上述分析, 得到岩藻聚糖硫酸酯最佳提取条件为x1=25,x2=-2.5, x3=12.5(X1=100,X2=1,X3=35),即提取温度100℃, 提取时间1h, 液料比35(mL:g)。

2.5 验证试验

按优化后的条件进行优化工艺验证试验, 岩藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可达 6.50%, 其中岩藻糖提取率为2.65%, 硫酸根提取率为1.36%。验证试验加权评分Y实测值为112.01, 比均匀实验中的12 组实验结果都高, 与回归模型的预测值 118.38相对误差为0.0539。由此表明试验中所设模型是合适的, 能够为海带岩藻聚糖硫酸酯提取工艺提供理论指导。

3 结论

采用均匀设计法优化海带岩藻聚糖硫酸酯提取工艺, 首次将粗多糖提取率(Yw)、岩藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)同时作为评价指标, 综合考虑各试验因素对以上三个指标的影响。结果表明:

(1)通过加权值Y得到的回归方程与通过Yw、Yf和Ys得到的回归方程相比具有较高精度和显著性。

(2)利用加权值Y得到的回归模型进行规划求解,得到优化提取工艺参数为提取温度100℃, 提取时间1 h, 液料比35(mL:g)。

(3)利用回归模型对实验结果进行预测, 其相对误差为5.39%。并且岩藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可达6.50%, 其中岩藻糖提取率为 2.65%, 硫酸根提取率为1.36%。

因此, 本文探讨和建立的海带中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺评价模型, 通过加权评分作为评价指标可综合考虑海带岩藻聚糖硫酸酯的产量和其主要成分含量, 对岩藻聚糖硫酸酯的工业提取提供了理论参考。

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